مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي
Summary
نحن تصف طريقة لاستهداف المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي عن طريق إما زرع القسطرة أو إجراء عملية حقن بلعة إلى البطين الجانبي الحق في الفئران. ونحن نركز بشكل خاص على إيصال أليغنوكليوتيد] العقاقير. هذه التقنية غير قابلة للتكيف بسهولة إلى الأدوية الأخرى والفئران.
Abstract
ونظرا لعدم القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ، والحاجة ليتم تسليمها مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعض الأدوية. ويركز تحديدا على مختبرنا أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز)، على الرغم من أن التقنيات يظهر في شريط الفيديو هنا يمكن أن تستخدم أيضا لتقديم مجموعة كبيرة من المخدرات الأخرى إلى الجهاز العصبي المركزي. أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز) لديها القدرة على أهداف ضربة قاضية تسلسل محدد 1 وكذلك نسب الإسوي التحول من جينات معينة 2. لتحقيق واسع النطاق ضربة قاضية الجينات أو الربط في الجهاز العصبي المركزي من الفئران، ويمكن أن يتم تسليم منظمات خدمات الإيدز في الدماغ باستخدام طريقين منفصلين الإدارة، وكلاهما علينا أن نظهر في شريط الفيديو.
الاستخدامات الأولى Alzet مضخات ناضح، وصله بجهاز القسطرة التي يتم زرعها جراحيا في البطين الجانبي. وهذا يسمح للمنظمات خدمات الإيدز إلى أن غرست بشكل مستمر إلى الجهاز العصبي المركزي لفترة محددة من الزمن. والثاني ينطوي على حقن بلعة واحدة من مرحباتركيز هرمون النمو من ASO إلى البطين الجانبي الأيمن. كلا أساليب استخدام نظام البطين الدماغي الماوس لتسليم ASO إلى الدماغ والحبل الشوكي بأكمله، على الرغم اعتمادا على احتياجات الدراسة، قد يكون من المفضل أسلوب واحد على الآخر.
Introduction
بعض الأدوية غير قادر على عبور حاجز الدم في الدماغ (BBB)، والتي تتطلب الجهاز العصبي المركزي مباشرة (CNS) التسليم. للتحايل على BBB، والمخدرات، يمكن تسليمها مباشرة الى الدماغ باستخدام أساليب وصفها. بينما مختبرنا ورقة التركيز هنا مفصلة عن أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز)، والمخدرات الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة، والأجسام المضادة، وناقلات العلاج الجيني، وغيرها، ويمكن أيضا أن يتم تسليمها من خلال النهج نفسه بالضبط.
بعض البروتينات تلعب دورا أساسيا في التسبب في أمراض الاعصاب. هذه البروتينات غالبا ما تشكل الأنواع السامة وتتراكم في المجاميع، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الموت العصبية والأمراض العصبية اللاحقة 3-4. في محاولة لإبطاء أو حتى وقف تطور هذه الأمراض، قد يكون الخيار العلاجي واحدة لاستهداف مباشرة وتقلل من البروتين المسبب للمرض. ومع ذلك، وغالبا ما توجد هذه البروتينات بتواجد مطلق من خلال الجهاز العصبي المركزي، مما يجعل من الصعب على البريد استهداف ffectively لهم على نطاق عالمي.
من أجل استهداف الجينات في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي بأكمله، ونحن إدارة منظمات خدمات الإيدز في الماوس السائل النخاعي (CSF) عن طريق البطين الجانبي لتجاوز BBB. هذا أسلوب معين يستفيد من نظام البطين الماوس الذي يغمر المخ بأكمله والحبل الشوكي، مما يسمح للتوزيع على نطاق واسع من منظمات خدمات الإيدز. نحن نستخدم منظمات خدمات الإيدز التي هي 18-20 مير RNA مثل الجزيئات التي تربط مباشرة تسلسل مرنا الهدف، واعتمادا على التعديلات الكيميائية ASO، إما A) تجنيد ريبونوكلياز-H إلى تدهور مرنا تؤدي إلى ضربة قاضية أو B) تحول الربط البديل 1 ، 2،16،17. وتجدر الإشارة إلى أن وجود جزيئات متعددة لهدمت بروتين معين في الجسم الحي، بما في ذلك shRNA. منذ هذه الجزيئات ليست هي محور هذه المقالة، نوجه القارئ إلى مراجعة المقالات التي أفضل آليات ضربة قاضية التفاصيل من العمل والمزايا / عيوب كل منها 5-6.
jove_content "> في العمل قبل، ونحن قد استخدمت منظمات خدمات الإيدز لاستهداف البروتين الفائق ديسموتاز 1 (SOD1) في نموذج الفئران المعدلة وراثيا من التصلب الجانبي الضموري (ALS) 7 (الشكل 4). الطفرات في SOD1 تحدث في حوالي 2٪ من جميع ALS 8 الحالات، على الرغم من أنه قد تم الافتراض مؤخرا أن SOD1 قد تلعب دورا هاما في ALS متفرقة فضلا 9-10. من خلال خفض مجمل مستويات SOD1 الفئران المعدلة وراثيا في ALS، البقاء على قيد الحياة بعد بداية حدثت زيادة كبيرة 7. وكانت هذه البيانات الهامة الأولى لإظهار أن العلاج ASO في الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون له أثر إيجابي عميق على نموذج مرض عصبي. ومنذ ذلك الحين، دخلت منظمات خدمات الإيدز تستهدف SOD1 الإنسان وأنجزت بنجاح المرحلة الاولى من التجارب السريرية البشرية مع آثار جانبية أقل (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ، كما قدمت في عام 2012 64 عشر الأكاديمية الأمريكية لعلم الأعصاب السنوي. خطط لتحريك منظمات خدمات الإيدز انتقل إلى المرحلة الثانية من التجارب تجري حاليا. <pالطبقة = "jove_content"> بينما كان استهداف SOD1 المظاهرة الأولى من استخدام منظمات خدمات الإيدز لعلاج الأمراض العصبية، ومنذ ذلك الحين أجريت عدة دراسات أخرى تبحث في أمراض مختلفة، وأهداف كل منها البروتين. في عامي 2010 و 2011، واستخدمت التحول من الربط بقاء البروتين من الخلايا العصبية الحركية 2 (SMN2) منظمات خدمات الإيدز أن في نماذج الماوس المعدلة وراثيا من ضمور العضلات الشوكي (SMA)، وأسفرت عن تحسن كبير في الظواهر المرض 11،12. هذه منظمات خدمات الإيدز الربط هي الآن في المرحلة الأولى من التجارب السريرية في الأطفال الذين يعانون من SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين مؤخرا أن إدارة عابر من منظمات خدمات الإيدز تستهدف الجين huntingtin تمكنوا من انقاذ بشكل كبير نموذج الفأر وهنتنغتون، حتى بعد أن عادت مستويات البروتين huntingtin إلى خط الأساس 13.في كل من هذه الدراسات، تم تسليم منظمات خدمات الإيدز إلى البطين الجانبي لخفض مجمل مستويات الجين أو الجينات من خلال تغيير الربطالجهاز العصبي المركزي بأكمله. كلا مضخات ناضح وحقن بلعة واحدة يمكن استخدامها لتقديم خدمات الإيدز إلى CSF. مضخات تسمح بطيئة، والتسليم مستمر، في حين أن intracerebroventricular (ICV) البلعة هو سريعة والحقن لمرة واحدة. وقد استخدمنا كل من هذه الأساليب مع النجاح، على الرغم من أننا لم تبلغ المقارنة المباشرة بين المضخة والبلعة في خط المعدلة وراثيا واحد.
استخدام منظمات خدمات الإيدز في الجهاز العصبي المركزي هو وسيلة قوية لخفض مجمل مستويات البروتين و / أو تغيير الربط من عدة بروتينات. بينما نستخدم منظمات خدمات الإيدز حصرا كعلاج لاضطرابات عصبية، ونحن ندرك أن الحقول الأخرى قد تستفيد أيضا من هذه التقنية. طالما أن البروتين من الفائدة يتم التعبير في الجهاز العصبي المركزي والهدف النهائي هو تحقيق تغييرات على مستوى الجهاز العصبي المركزي في التعبير الجيني، وذلك باستخدام منظمات خدمات الإيدز في تقنيات أثبتت قد تكون مفيدة جدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على توصيل الأدوية عالميا في الجهاز العصبي المركزي كما هو موضح في الفيديو هي تقنية قوية للغاية التي هي سهلة التعلم والاستخدام على حد سواء. مع الممارسة، وزرع مضخة واحدة أو ICV بلعة يمكن أن تكتمل في 10 دقيقة، والسماح لأفواج كبيرة من الفئران لتلقي العلاج في نفس الوقت. هذا هو مفيدة بشكل خاص للدراسات مع قراءات السلوكية، كما بأعداد أكبر لسلوك الماوس حاسمة للمساعدة في رؤية اختلافات كبيرة.
وبناء على تجاربنا تقديم خدمات الإيدز عن طريق المضخات وحقن بلعة، لاحظنا بعض الايجابيات والسلبيات لكل طريقة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه هي آراء في مختبرنا، وربما لا يكون صحيحا لجميع الموديلات الماوس والفئران.
نجد الاستفادة من استخدام مضخات هو قدرتها على تقديم كمية عالية من ASO منذ يتم توزيع ASO على مدى فترة أطول بكثير من الوقت. هذا عادة ما يعادل ضربة قاضية يعد المستمر أو الربط بعد نشطASO التسريب، على الرغم من أن هذا قد لا يكون الحال دائما. السماح للمضخات أيضا لوضع جدول زمني دقيق لتسليم ASO (14 يوما، 28 يوما، أو 42 يوما) ويمكن تغيير مضخات مرة واحدة للسماح للتسريب ASO حتى تعد نشطة. ومع ذلك، لاحظنا أن تغيير تضخ أكثر من مرة يزيد من تقلب بسبب تشكيل جيوب ليفية حول المضخة التي تمنع من امتصاص السوائل مضخة بشكل صحيح. والعيب من المضخات هو أن بعض الفئران لا يتسامح مع مضخة، فضلا عن غيرهم. إذا كان خط المعدلة وراثيا كنت تعمل مع أكثر هشاشة، قد يكون مضخة مرهق للغاية. تحتاج إلى مضخات أيضا إلى إزالتها بعد ضخ النهائي، إخضاع الفئران لعملية جراحية أخرى والتخدير المضافة. إذا تقوم بعمل السلوك، من المهم بصفة خاصة لإزالة مضخة والسماح لمدة 1-2 أسابيع على الأقل من الانتعاش منذ وجود المضخة سوف تؤثر على بعض السلوكيات في الفئران.
مع ICV بلعة حقن، ميزة واحدة من حيث التكلفة. هناكالاستثمار مقدما لشراء المحاقن والإبر، ولكن مع مرور الوقت، والحقن البلعة هي فعالة من حيث التكلفة أكثر حيث لا توجد مضخات / أنابيب / أنابيب القسطرة لشراء. وعموما، هناك أقل تصل بين الحفاظ على مع حقن بلعة ICV نظرا لعدم وجود قنية والمضخات. نجد أيضا أن بلعة ICV يمكن استخدامها لتقديم خدمات الإيدز على الفئران الأصغر سنا الهشة و / أو أكثر. والعيب من ICV بلعة هو أنه في حقنة واحدة. لا قدر ASO العام يمكن تسليمها من خلال هذا الطريق، وإذا كانت مدة عمل ASO المستخدمة قصيرة، فإن الآثار ضربة قاضية / الربط أيضا أن تكون قصيرة الأجل.
كل من مضخات التناضحي فضلا عن البلعة ICV لديها القدرة على تقديم خدمات الإيدز التي يمكن أن البروتينات ضربة قاضية أو تغيير الربط من الجينات في الجهاز العصبي المركزي بأكمله القوارض، وهي تقنية لها تطبيقات واسعة في مجالات متعددة ذات صلة علم الأعصاب. نقترح تجريب كل أساليب التسليم إذا كنت غير متأكد من طريقة التعاطي هو الانسب لبلدكمدراسة pecific.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر كيرت ميزر من إيزيس الصيدلة لتقديم المشورة المتعلقة جراحة بلعة ICV، وكذلك إيزيس الصيدلة ككل لتوريد مختبرنا مع منظمات خدمات الإيدز. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر كاري Shaner لمراجعة هذه المادة. معتمدة TMM وSLD بواسطة المعاهد الوطنية للصحة منح P50AG005681، K08NS074194، وR01NS078398.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
| Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
| Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
| Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
| 2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
| Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
| 0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
| 0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
| p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
| Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
| Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
| Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
| .2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
| 1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 100% Ethanol | |||
| PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
| Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
| Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
| 5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
| Alcohol Pads | Select | #521 | |
| Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
| Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
| CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
| Antibiotic Cream | |||
| Eye Ointment | |||
| Electric Shaver | |||
| 70% Ethanol | |||
| 10% Provadone Iodine | |||
| 3% Hydogen Peroxide | |||
| Warming Pad | |||
| Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
| Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
| Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
| Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
| Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
| Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
| Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
| Oxygen/Isoflurane System |
References
- Crooke, S. T., Bennett, C. F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).
- Sazani, P., Kole, R. Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing. The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System. Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).
- Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents. The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).
- Smith, R. A., Miller, T. M., et al. Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).
- Rosen, D. R., Siddique, T., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 6415-62 (1993).
- Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons. Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).
- Furukawa, Y. Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).
- Hua, Y., Sahashi, K., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Passini, M. A., Bu, J., et al. Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy. Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).
- Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. Sustained Therapeutic Reversal of Huntington’s Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis. Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
- Planel, E., Richter, K. E. G., et al. Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia. The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).
- Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends in Molecular Medicine. , (2012).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).
