Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Il protocollo seguito è stato approvato dalla cura degli animali Istituzionale e utilizzare i comitati alla Washington University di St. Louis ed è in conformità con il National Institutes of linee guida di salute per l'uso di animali da laboratorio. Se questa è la prima volta che l'esecuzione di interventi chirurgici, si consiglia guardando l'articolo JoVE su interventi chirurgici di roditori come introduzione prima di iniziare 14. ASO possono essere consegnati al sistema nervoso centrale del mouse sia attraverso infusione pompa osmotica e una singola iniezione in bolo ICV. A causa di questo, la procedura descritta di seguito è suddiviso in due segmenti. Pro e contro di ciascun metodo verranno toccati nella sezione Discussione. Le coordinate utilizzato nei protocolli sono per adulti C57BL6 e B6C3 topi. Coordinate ratto corrispondenti si trovano nella tabella 1. Alzet pompa osmotica 1. Preparazione di Alzet Pompe osmotici Stabilire un drap sterileE e rilasciare attentamente le seguenti voci su di esso facendo attenzione a non toccare direttamente tutto pur di mantenere la sterilità: pompa osmotica (s), modulatore di flusso (s), 1 ml siringa sterile (s), bisturi, e le sezioni di tubo (1 pezzo di tubo = 5 pompe). Per i topi, ci sono tre opzioni per le pompe: 14 giorni, 28 giorni, e 42 giorni (Figura 2A). Stappare e riempire sterili provette coniche da 50 ml con soluzione fisiologica ml 15-20. Fino a 6 pompe assemblate possono essere aggiunti per ogni tubo conico. Riempire un piatto p60 Petri con il 100% di etanolo. Aggiungere il numero appropriato di cateteri a etanolo. Per i topi, la lunghezza del catetere è di 2,5 mm. Filtrare ogni ASO in tante provette da 1,5 ml Eppendorf, se necessario. Include un tubo Eppendorf riempito con soluzione fisiologica 0,9% sterile per riempire il tubo con. Una volta che tutto è pronto, indossare guanti sterili. Assicurarsi di non toccare nulla che non sia sterile. Cambiare i guanti se necessario. Per ogni ASO da utilizzare, riempire una siringa da 1 mle loadpumps posizionando l'ago nel foro superiore e lentamente riempiendo fino perdite in eccesso fuori. Continuare fino a quando tutte le pompe sono riempiti. Stappare le flow-modulatori e inserire nelle pompe. Spingere il flusso-modulatore quasi tutto il modo in, lasciando un'apertura di mm 3-5. Utilizzando la lama del bisturi, tagliare ogni pezzo di tubo in 5 segmenti uguali. Prendere un pezzo di tubo, riempire con soluzione salina sterile utilizzando una siringa da 1 ml, ed inserire la parte superiore del modulatore di flusso in una estremità del tubo. Poi prendere una cannula da etanolo e collegarlo all'altra estremità del tubo. La pompa è montata. Collocare la pompa completamente assemblato nella sterile da 50 ml tubo conico con soluzione fisiologica per l'innesco. L'adescamento consente per le pompe ad assorbire fluido di avviare il rilascio di farmaci e venire alla temperatura corretta. Il tempo di aspirazione: 14 pompe giorno: 4-6 ore, 28 pompe di giorno: 40 ore, 42 pompe di giorno: 60 ore. Una volta terminato il montaggio delle pompe, tappare i tubi conici e posto in un ambiente pulito37 ° C bagnomaria fino chirurgico. 2. Procedura di pre-chirurgica Pulire tutto giù con il 70% di etanolo per sterilizzare la zona e fissare teli sterili sul piano del tavolo e stereotax per creare un campo sterile. È importante essere consapevoli del campo sterile tutta la chirurgia. Accendere il seguente: sterilizzatore Perlina, Pad Riscaldamento, luce, lettura digitale, e Ossigeno / Sistema Isoflurano (Figura 1). I seguenti elementi saranno necessari se facendo un singolo intervento chirurgico o di un intero lotto di interventi chirurgici come noi abitualmente facciamo: 1 paio di pinze, 1 pinza emostatica curva, 1 paio di piccole forbici, 1 paio di piccole forbici spuntate curve, 1 ratto taglierina dell'osso , 1 pinza emostatica retta, 5-0 punti di sutura in nylon, 1 tubi conici con il 70% di etanolo, 1 tubo conico con il 95% di etanolo, 1 tubo conico con iodio, 1 tubo conico con perossido di idrogeno, pacchetto di tamponi di cotone sterile, 1 bottiglia di super colla, 1 tubo di pomata antibiotica, 1 tubo di occhiolubrificante, e 1 rasoio elettrico. Inserire le punte di entrambe le coppie di forbici, pinze, e emostatica curva nello sterilizzatore tallone per 15 sec. Rimuovere e mettere in etanolo al 70%. Quando si esegue più di un intervento chirurgico, sterilizzare nuovamente le punte degli strumenti in tra animali. Ruotare la isoflurano al 4% e O 2-0,4 L / min e flusso di gas diretto alla camera. Abbiamo il nostro sistema / ossigeno isoflurano calibrato almeno una volta all'anno per assicurare che stiamo fornendo la giusta quantità di anestesia. Posizionare il mouse nella camera e attendere che la respirazione è notevolmente rallentato. Rimuovere il mouse ed eseguire un pizzico punta a garantire il mouse è completamente incosciente. Radere i peli dalla parte superiore della spalla fino a tra gli occhi. Se il mouse comincia a svegliarsi, posizionare il mouse nuovamente nella camera fino a quando il mouse è ancora del tutto inconsapevole, confermando con un pizzico punta. Posizionare il mouse anestetizzato sulla stereotax e spingere il cono sopra il naso.Sii gentile come i denti e le ossa sono fragili. Dirigere il flusso del gas al stereotax per mantenere il mouse anestetizzato. E 'importante controllare di tanto in tanto per assicurarsi che il mouse è completamente incosciente con un pizzico punta tutta la chirurgia. Fissare la testa con le barre di orecchio. Preferiamo livellamento barre orecchio, sebbene di indirizzare il ventricolo laterale, un cranio perfettamente piano non è necessaria a causa delle grandi dimensioni del ventricolo. Girare il livello isoflurano fino al 2,0% per la manutenzione. Dab occhio unguento su ogni occhio. Come si vede nel video, giaceva un telino sterile sopra il mouse in modo che solo la base del collo e della testa sono esposti. Poi disinfettare la zona chirurgica pulendo la sommità della testa e del collo con un movimento circolare partendo dal centro dell'area rasata e spostando verso l'esterno prima con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 95%, seguito da un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. Si consiglia di utilizzare un sistema di retroazione rettale sonda temperatura controllata di riscaldamento che assicurala temperatura del topo rimane ad una stabile 37 ° C. Se la temperatura del mouse diminuisce durante l'intervento, il recupero post-chirurgico può richiedere più tempo e l'ipotermia risultante può portare ad attività della proteina aberrante, compresa iperfosforilazione dei microtubuli proteina Tau associata 15. Dopo aver impostato il sistema di riscaldamento, si è ora pronti per iniziare l'intervento chirurgico. 3. L'impianto di Alzet pompa osmotica Prima di iniziare l'intervento, messo su un nuovo paio di guanti sterili. Poi, con pinze e un piccolo paio di forbici, fare una incisione nella pelle dalla base del collo sopra cranio dell'animale fino tra gli occhi Prendere le forbici smussate con la curva rivolta verso l'alto e far scorrere sotto la pelle alla base della parte posteriore del collo verso hindlimb sinistra. Non ci dovrebbe essere alcuna resistenza. Se non c'è, togliere le forbici e riprovare. Questo forma la tasca sottocutanea per la pompa osmotica. Wipe il cranio pulita con tamponi di cotone sterile, seguito da un batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata per migliorare bregma. Pulire i ml provette coniche 50 che contengono le pompe per mantenere la sterilità delle pompe. Prendere accuratamente una pompa dal tubo conico utilizzando all'emostato curvo, avendo cura supplementare che la pompa non tocca i lati del tubo conico. Tenere la base della pompa con una pinza e spingere il modulatore flusso nel resto del modo con la pinza emostatica ricurva. Tenere la pompa dove il modulatore di flusso e tubi si incontrano con la pinza emostatica curva. Inserire la pompa sotto la pelle alla base del collo e spingerlo indietro verso la hindlimb sinistra fino a fine corsa senza resistenza. Fare attenzione a non lasciare che il tocco niente catetere. Con la pinza emostatica curva, afferrare la cannula alla scanalatura in cui la parte superiore incontra il piedistallo. Spostare il driver cannula in posizione e fissarlo in posizione. Posizionare una singola goccia di colla super sulla base della cannula. Push la parte superiore della cannula nel conducente e posizione in modo che il tubo sia puntato subito indietro. Toccare la punta del catetere di bregma e azzerare le coordinate sul display digitale. Sollevare e spostare il catetere 1,1 millimetri lateralmente verso destra e 0,5 mm posteriormente (Figura 2B). Tenere la pelle fuori strada con la pinza emostatica curva. Guidare il catetere metallico sottile attraverso il cranio fino alla pressione saldamente la base cannula di plastica contro la parte superiore del cranio. Il catetere di metallo può essere guidato direttamente attraverso il cranio nei topi a causa della relativa cranio sottile. Se si utilizza ratti, praticare un foro nel cranio prima di abbassare il catetere. Tirare qualsiasi pelle che ha colla su lontano dal cranio. Con il driver cannula tenendo la cannula / catetere in posizione, attendere 1-2 min per la colla per asciugare completamente. Quando si pratica, per valutare il posizionamento del catetere, iniettare 20-40 ml di 2,5% FastGreen Dye attraverso il tubo (Figura 2C). Attendere 2-3 minuti, perfuse il mouse con PBS 1X 0,03% eparina, e rimuovere il cervello. Tagliare coronale al sito del catetere. Se il catetere è stato posizionato nel ventricolo, il colorante viene perfuso in tutto il sistema ventricolare del mouse (Figura 2D). Tenere il catetere in posizione con la pinza emostatica curva, aumentando nel contempo il conducente. Rilasciate lentamente all'emostato per assicurare che la cannula sia correttamente fissato al cranio. Con un tampone di cotone, premere sulla parte superiore della cannula. Montare i Clippers ossei ratto nel boschetto tra la parte superiore e la base della cannula. Agganciare la parte superiore della cannula mentre ancora premendo con il bastoncino di cotone. Cercare di mantenere il livello tagliaunghie in modo da non staccare la cannula dal cranio. Se la cannula fa venire scollata, in modo rapido re-incollare e applicare una pressione con un tampone di cotone per altri 2 min. Usando il filo di sutura 5-0, emostatico regolare, e pinze, sutura lungo la piena apertura, prestando particolare attenzione a destra sopra la cannula. Usiamo un running orizzontale materasso sutura (vedi Figura 5) in virtù della grande incisione sul cranio. Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica sulla testa e sul collo. Svitare l'orecchio bar e allentare il cono di naso. Rimuovere il mouse dalla stereotax e posto su un rilievo di riscaldamento per il recupero. Monitorare i topi strettamente per la durata del recupero, in genere comprese tra 10-30 minuti. Verificare ogni 2-3 minuti fino a quando il mouse comincia a camminare in giro e che si governa. 4. Assistenza post-operatoria Monitorare i topi al giorno dopo l'intervento chirurgico per la prima settimana. Se il mouse sembra essere nel dolore o disagio, si consiglia di fornire il mouse con un mg / kg iniezione sottocutanea di 5 Carprofen una volta ogni 24 ore per 5 giorni, al fine di alleviare il dolore. Se vi sembra essere un'infezione, applicare generosamente pomata antibiotica all'area quotidiana e consultare un veterinario che si occupa di assicurare che la ferita guarisce correttamente. RTogliete il 5-0 sutura in nylon 7-10 giorni dopo l'intervento per evitare irritazioni dal filo di sutura. 5. Modifica o rimozione Alzet pompa osmotica Dopo che la pompa è fatto infondendo attivamente ASO, può essere modificato o completamente rimosso. Seguire la stessa procedura di pre-chirurgia come sopra, con le seguenti modifiche: 1) non sarà necessario le forbici curve, emostatica curva, frese ossee ratto, né il display digitale, e 2) invece di preparando la testa del topo, barba e disinfettare la parte posteriore del mouse all'incrocio tra la pompa e il tubo. Fare una incisione 1,5 cm sul retro del mouse, perpendicolare alla giunzione pompa / tubi, con pinze e forbici. Estrarre con cautela la pompa fuori l'incisione senza significativamente trazione / spinta sul tubo come può urtare il catetere. Per rimuovere la pompa, tagliare il tubo di circa 0,5 cm al di sopra del modulatore di flusso e di toccare la supercolla per il tubo to sigillo chiuderlo. Attendere 1-2 min per asciugare la colla. Riposizionare il tubo nella incisione e sutura chiusa. Dab pomata antibiotica sulla pelle suturata e posizionare il mouse su un blocco di recupero riscaldato. Per cambiare la pompa, hanno appena fatto pompe pronto insieme a un piatto di 10 cm riempito con il 95% di etanolo. Cateteri non sono necessari con le nuove pompe. Afferra una nuova pompa con le pinze. Immergere le dita in etanolo, prendere in mano la pompa, e scartare il flow-modulatore. Poi, con cautela e lentamente tirare fuori la vecchia pompa dal modulatore di flusso attaccato al tubo e cannula. Non appena è spento, far scorrere lentamente la nuova pompa, assicurando che il modulatore di flusso non tocca mai l'esterno del mouse. Reinserire la nuova pompa attraverso l'incisione di nuovo nel pacchetto sottocutaneo e sutura la cute. Dab pomata antibiotica sulla ferita del mouse e posto sul pad di recupero. Proprio come con l'impianto pompa, monitorare i topi al giorno dopo l'intervento chirurgico per verificare pain / disagio e infezioni. Trattare con Carprofen e antibiotici come ritenuto necessario. ICV BOLO 6. Procedura di pre-chirurgica Seguire la stessa procedura di pre-chirurgia come nella Sezione 2 di cui sopra con le seguenti modifiche: 1) non sarà necessario forbici curve, emostatica curva, o utensili da taglio osseo di ratto; 2) Pulire a 10 microlitri Hamilton siringa e l'ago con acqua sterilizzata e carico con ASO e 3) fissare la siringa e l'ago per l'apparato stereotassico in cui si trovava il conducente cannula. 7. Bolo di ASO Con pinze e un piccolo paio di forbici, fare un'incisione dalla base del collo fino a tra gli occhi. Pulire il cranio puliti con tamponi di cotone sterile, seguita da un batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata per migliorare bregma. Portare la siringa / ago in posizione e fissare. Assicurarsi che la parte smussata dell'ago affronta posteriore. Abbassarel'ago finché non tocca bregma. Azzerare tutte le coordinate. Spostare l'ago lateralmente verso destra 1,0 millimetri e 0,3 millimetri anteriore (Figura 3A). Guidare lentamente l'ago attraverso il cranio solo fino a quando il foro dell'ago è a filo con la parte superiore del cranio. Ancora una volta, questo può essere fatto a causa dello spessore ridotto del cranio mouse. Azzerare la coordinata z ed abbassare l'ago -3.0 mm ad una velocità di 1 mm / sec (Figura 3B). Attendere 2-3 minuti per il cervello per sigillare intorno all'ago. Consegnare il pieno 10 ml di ASO a una velocità di 1 ml per sec. Attendere 2-3 minuti. Usiamo una velocità di infusione 1 ml per ASOS nel ventricolo, anche se questo tasso può variare tra diversi farmaci. Quando si pratica, verificare il corretto posizionamento dell'ago, fornendo 10-20 ml di 2,5% FastGreen Dye. Perfondere il mouse con 1X PBS 0,03% eparina presto dopo infusione colorante e rendere sezioni coronali del cervello per verificare che il colorante è nel sistema ventricolare (Figura 3C). <li> Tenere premuto un tampone di cotone contro il cranio alla base dell'ago. Sollevare l'ago a una velocità di 1 mm al sec. Appena l'ago è fuori del cranio, rotolare il tampone di cotone sopra il foro dell'ago e tenere per 1 min per impedire qualsiasi fuoriuscita ASO. Suturare la pelle chiuso, applicare pomata antibiotica, e il luogo del mouse sul tappetino di recupero riscaldato. A seconda della concentrazione ASO, potrebbero essere necessari 20 minuti per un paio d'ore per riprendersi completamente. Proprio come con l'impianto della pompa, controllare i topi al giorno dopo l'intervento chirurgico per controllare il dolore / disagio e infezioni. Trattare con Carprofen e antibiotici come ritenuto necessario.