Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Aşağıdaki protokol St Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Deney hayvanlarının kullanımı için Sağlık kuralları Ulusal Sağlık Enstitüleri uygun değil. Bu cerrahisine ilk defa ise, biz 14 başlamadan önce bir giriş olarak kemirgen operasyonlarında vallahi makale bakarak öneririz. Asos ozmotik pompa infüzyon ve tek ICV bolus hem boyunca fare MSS teslim edilebilir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı prosedürü iki parça halinde kadar bozuldu. Her yöntem için artılarını ve eksilerini Tartışma bölümünde değinilecektir. Protokolleri kullanılan koordinatları yetişkin C57BL6 ve B6C3 fareler içindir. Sorumlu sıçan koordinatları Tablo 1'de bulunabilir. Alzet ozmotik POMPA 1. Alzet Ozmotik Pompalar hazırlanması Steril bir drap uzandıE ve doğrudan kısırlık korumak için bir şey dokunmamaya dikkat çekerken dikkatle üzerine aşağıdaki öğeleri bırakın: ozmotik pompa (lar), akış modülatörü (ler), 1 ml steril şırınga (ler), neşter bıçak ve boru bölümleri (boru = 5 pompa 1 adet). 14 gün, 28 gün ve 42 gün (Şekil 2A): fareler için, pompalar için üç seçenek vardır. Kapağını çıkarın ve 15-20 ml serum fizyolojik ile steril 50 ml konik tüpler doldurun. Kadar 6 monte pompa konik tüp başına eklenebilir. % 100 etanol ile bir p60 Petri kabı doldurun. Etanol kateter uygun sayıda ekleyin. Fareler için, kateter uzunluğu 2.5 mm'dir. Gerekli olduğu kadar çok 1.5 ml lik Eppendorf tüpleri içine her ASO filtre. Tüp doldurmak için steril% 0.9 tuzlu su ile dolu bir Eppendorf tüpü içerir. Her şey hazırlandıktan sonra, steril eldiven koymak. Steril olmayan bir şey dokunmamaya dikkat edin. Gerekirse eldiven değiştirin. Her ASO kullanılmak üzere, bir 1 ml şırınga dolguve üst deliğe iğne yerleştirerek ve yavaş yavaş kadar aşırı sızıntı doldurarak loadpumps. Pompaların doldurulana kadar devam edin. Akış modulatöru kapağını çıkarın ve pompa takın. Bir 3-5 mm boşluk bırakarak, hemen hemen tüm yol akışını-modülatör itin. Neşter bıçak kullanarak, 5 eşit parça halinde boru her parça kesti. Hortumun bir parça alır, bir 1 ml şırınga kullanarak steril tuzlu su ile doldurun ve Hortumun bir ucunu akış modülatör üst yerleştirin. Daha sonra etanolden bir kanül almak ve borunun diğer ucuna bağlanmalıdır. Pompa şimdi tam monte edilir. Astar için tuzlu su ile steril bir 50 ml'lik konik bir tüp içine tam olarak monte edilmiş pompa yerleştirin. Astar ilaç dağıtım başlatmak için sıvı içinize yanı sıra uygun sıcaklığa gelmesini pompalar için izin verir. Astar süresi: 14 gün pompalar: 4-6 saat, 28 gün pompalar: 40 saat, 42 gün pompalar: 60 saat. Pompa montajı bittiğinde, bir temiz konik tüpler ve yer kap37 ° cerrahi kadar C su banyosu. 2. Ön cerrahi Prosedürü Alan sterilize ve steril bir alan oluşturmak için masa üstü ve stereotaksi üzerine steril örtüler bırakmaya% 70 etanol ile her şeyi silin. Bu, tüm ameliyat boyunca steril alanın dikkatli olmak önemlidir. Aşağıdaki açın: Boncuk Sterilizatör, ısıtma pedi, Işık, Dijital Okuma ve Oksijen / İsofluranın Sistemi (Şekil 1). Forseps 1 çift, 1 kavisli hemostat, küçük makas 1 çift, küçük kavisli künt makas 1 çift, 1 sıçan kemik kesici: Tek bir ameliyat veya bir bütün toplu ameliyatları rutin gibi birini yaparak, aşağıdaki öğeleri gerekecektir , 1 düz hemostat, 5-0 naylon sütür,% 70 etanol ile 1 konik tüpler,% 95 etanol ile 1 konik tüp, iyot ile 1 konik tüp, hidrojen peroksit ile 1 konik tüp, steril pamuklu paket, süper 1 şişe tutkal, 1 tüp antibiyotik merhem, göz 1 tüpyağ ve 1 elektrikli tıraş makinesi. 15 saniye için boncuk sterilizatör içine makas, forseps, ve kavisli hemostatı iki çift ipuçları yerleştirin. Çıkarın ve% 70 etanol içinde. Birden fazla ameliyat yaparken, hayvanlar arasında araçların ipuçları yeniden sterilize. % 4 izofluran ve O 2-0,4 L / dk ve odasına doğrudan gaz akışını açın. Biz anestezi uygun miktarda teslim olmasını sağlamak için yılda en az bir kalibre bizim izofluran / oksijen sistemi var. Yeri odasında fare ve nefes kadar beklemek önemli ölçüde yavaşlar. Fareyi çıkarın ve fare tamamen bilinçsiz olmasını sağlamak için bir ayak tutam gerçekleştirin. Kadar göz arasında 'de omuz üstünden saç tıraş. Fare uyanmak başlarsa fare bir ayak tutam ile teyit, yine tamamen bilinçsiz kadar, odasına geri fare yerleştirin. Stereotaksi üzerine anestezi fare yerleştirin ve burun üzerinde burun konisi itin.Dişleri ve kemikleri kırılgan gibi nazik olun. Fare anestezi tutmak için stereotaksi için gaz akışını yönlendirmek. Bu zaman zaman fare ameliyat boyunca bir ayak tutam tamamen bilinçsiz olduğundan emin olmak için kontrol etmek önemlidir. Kulak çubukları ile baş sabitleyin. Biz lateral ventrikül hedef olsa da, kulak çubukları tesviye tercih, mükemmel düzeyde kafatası nedeniyle ventrikül büyük olması gerekli değildir. Bakım için% 2.0 için izofluran seviyesini aşağı çevirin. Her bir göz damlasını, göz merhemi. Videoda görüldüğü gibi boyun ve baş sadece temel maruz böylece, fare üzerinde bir steril örtü yatıyordu. Daha sonra traş alanının merkezinde başlayan ve çubuk çubuk iyot batırılmış bir pamuk takip,% 95 etanol batırılmış bir pamuk ile ilk dışa doğru hareket eden bir dairesel hareketlerle baş ve boyun üst silerek cerrahi alan dezenfekte edin. Biz sağlayan bir rektal prob geri besleme sıcaklık kontrollü ısıtma sistemi kullanmanızı öneririzfare sıcaklığı istikrarlı bir 37 ° C 'de devam Fare sıcaklığı ameliyat sırasında azalırsa, ameliyat sonrası iyileşme daha uzun sürebilir ve ortaya çıkan hipotermi protein Tau 15 ilişkili mikrotübül bir hiperfosforilizas dahil olmak üzere, anormal protein aktivite yol açabilir. Isıtma sistemi kurduktan sonra, artık ameliyat için hazırız. 3. Alzet Ozmotik Pompa implantasyonu Ameliyat başlamadan önce, steril eldiven yeni bir çift koymak. Daha sonra, forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla hayvanın kafatası üzerinde boyun tabanından deride bir kesi yapmak Yukarı bakacak şekilde eğrisi ile künt makas alın ve sol bacak doğru boyun sırt dibinde cilt altında kaydırın. Hiçbir direniş olmalıdır. Varsa, makas kaldırıp tekrar deneyin. Bu, ozmotik pompa için deri altı cep oluşturur. Wipe bir pamuklu çubukla takip steril pamuklu çubukla temiz kafatası, bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış. Pompaların sterilite korumak için pompaları içeren 50 ml konik tüpler silin. Dikkatlice pompa konik tüp kenarlarına temas edip etmediğini özen göstererek, kavisli hemostat kullanarak konik tüp bir pompa almak. Forseps ile pompanın tabanı tutun ve kavisli hemostatla şekilde geri kalanında akış modülatör itin. Akış modülatör ve boru kavisli hemostat ile bir araya pompa tutun. Boyun dibinde deri altına pompa takın ve şu ana kadar bu direniş olmadan gidecek gibi sol bacak doğru geri itin. Kateter dokunmatik bir şey izin için dikkatli olun. Kavisli hemostatla, üst kaide karşılayan oluk de kanül kapmak. Yerine kanül sürücü hareket ettirin ve yerine sabitleyin. Kanül baz süper yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Irinh sürücü ve boru düz geri işaret böylece pozisyona kanül üst. Bregma için kateter ucu dokunun ve Dijital ekranda koordinatları sıfır. Kateter kaldırın ve sağ-arka 0.5 mm (Şekil 2B) yanal olarak 1,1 mm hareket etmektedir. Kavisli hemostatla yolumdan cilt tutun. Plastik kanül tabanı güvenli bir kafatasının üst karşı basılana kadar kafatası ile ince metal kateter sürün. Metal kateter göreli ince kafatası nedeniyle farelerde kafatası doğrudan sürülebilir. Sıçan kullanıyorsanız, kateter indirmeden önce kafatasında bir delik açın. Uzak kafatası Üzerinde yapışkan olan herhangi bir cilt çekin. Yerine kanül / kateter tutan kanül sürücü ile, tam kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. Kateter yerleştirme değerlendirmek için, pratik zaman, boru (Şekil 2C) ile% 2.5 FastGreen Boya 20-40 ul enjekte. 2-3 dk, Perfüzyonun bekleyin1X PBS 0.03% heparin ile e fare, ve beyin çıkarın. Kateter yerinde koronal kesin. Kateter ventriküle yerleştirildi durumunda, boya fare ventriküler sistemine (Şekil 2B) boyunca perfüze edilir. Sürücü yükselterek kavisli hemostatla kateter yerinde tutun. Yavaşça kanül düzgün kafatasına güvenli olduğundan emin olmak için hemostat bırakın. Bir pamuklu çubukla, kanül üst bastırın. Kanül üst ve taban arasındaki koru içine sıçan kemik kesme makineleri takın. Hala pamuklu çubukla tuşuna basılı iken kanül üst kapalı klibi. Kesme seviyesi denemek ve devam böylece kafatası kanül ayırmak için değil. Kanül Neşesiz geliyor yoksa, hızlı bir şekilde yeniden yapıştırıcı ve ek 2 dakika süreyle bir pamuklu çubukla basınç uygulayın. Sağ kanül üzerinde ekstra dikkat, 5-0 dikiş ipliği, düzenli hemostat ve forseps, tam açılış boyunca dikiş kullanma. Bir runnin kullanınkafatası üzerinde büyük bir kesi nedeniyle g yatay yatak sütür (bkz. Şekil 5). Baş ve boyun antibiyotik merhem bir dab uygulayın. Sökün kulak çubukları ve burun konisi gevşetin. Kurtarma için bir ısınma pad üzerinde stereotaksi ve yerden fareyi çıkarın. Tipik olarak 10-30 dakika arasında değişen, iyileşme süresi boyunca yakından fareler izleyin. Fare dolaşıyor ve kendisini tımar başlayana kadar her 2-3 dakikada bir kontrol edin. 4. Ameliyat sonrası Bakım Ilk hafta için ameliyat sonrası günlük fareler izleyin. Bir fare ağrı veya sıkıntı gibi görünüyor, biz ağrı gidermek için en fazla 5 gün boyunca her 24 saat bir kez Carprofen bir 5 mg / kg deri altı enjeksiyonu ile fare sağlayan tavsiye ederiz. Bir enfeksiyon olması görünüyorsa, cömertçe günlük bölgeye antibiyotik merhem uygulamak ve yara doğru iyileşir sağlamak için bir Katılan Veteriner danışın. R5-0 naylon dikiş dikiş ipliğinin gelen tahrişi önlemek için ameliyat sonrası 7-10 gün kaydının silinmesi. 5. Alzet Ozmotik Pompa değiştirme veya kaldırma Pompa aktif ASO beslerken yapıldıktan sonra, ya değişti ya da tamamen kaldırılabilir. Aşağıdaki değişikliklerle yukarıda aynı ön-cerrahi prosedürü takip edin: 1) Eğer kavisli makas, eğri hemostat, sıçan kemik kesiciler, ne de Dijital Ekran gerekmez, ve fare yerine başkanı hazırlıyor 2), tıraş ve Pompa ve boru kavşağında fare arka dezenfekte. Forseps ve makas kullanarak, dik pompa / boru kavşak, fare arkasında bir 1.5 cm kesi olun. Dikkatle önemli ölçüde çekerek / bu kateter kavanoz olabilir boru üzerinde koymadan kesi dışarı pompa çekin. Pompayı kaldırmak için, hakkında 0.5 cm akışını modülatörü üzerindeki boru klibi ve boru t yapıştırıcı temaso mühür onu kapattı. Kuru tutkal için 1-2 dakika bekleyin. Boru geri kesi ve dikiş kapalı içine yerleştirin. Sütüre cilt ve yer ısıtılmış bir kurtarma pad üzerinde fareyi üzerine dab antibiyotik merhem. Pompa değiştirmek için, taze% 95 etanol ile dolu bir 10 cm tabak birlikte pompa hazır hale gelmiştir. Kateterler yeni pompa ile gerekli değildir. Forseps ile yeni bir pompa tut. Etanol içine parmaklarınızı batırın, pompa tutun, ve akış-modülatör atın. Daha sonra, dikkatlice ve yavaşça tüp ve kanül bağlı akış modülatöründen eski pompa çekin. En kısa sürede onu olduğu gibi, yavaş yavaş akış modülatörü Farenin dış ile hiç temas etmez sağlamak, üzerinde yeni pompa kaydırın. Deri altı paket ve dikiş cilt geri kesiden yeni pompa yeniden takın. Kurtarma pad üzerinde yara ve yerde fare dab antibiyotik merhem. Sadece pompa implantasyonu olduğu gibi, p kontrol etmek için ameliyattan sonra günlük fareler izlemekain / rahatsızlık ve enfeksiyonlar. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi. ICV BOLUS 6. Ön cerrahi Prosedürü , 2) ile sterilize edilmiş su ve yük ile 10 ul Hamilton şırınga ve iğne temiz 1) kavisli makas, eğri hemostat ya da fare kemik kesiciler gerekmez: aşağıdaki değişikliklerle birlikte yukarıda Bölüm 2'de olduğu gibi aynı önceden cerrahi prosedürü izleyin ASO ve 3) kanül sürücü bulunduğu stereotaksik aparat için şırınga ve iğne takın. 7. ASO Bolus Enjeksiyon Forseps ve makas küçük bir çift kullanarak, gözler arasında en fazla boyun tabanından bir kesi yapmak. Çubukla bregma geliştirmek için hidrojen peroksit batırılmış bir pamuk takip steril pamuklu çubuk, temiz kafatası silin. Yerine şırınga / iğne taşımak ve güvenli. İğnenin kesik kısmı arka baktığından emin olun. Altiğne Bregma dokunduğu kadar. Koordinatları tüm Zero. Doğru 1.0 mm ve 0.3 mm anterior (Şekil 3A) yanal olarak iğne hareket ettirin. Iğne deliği kafatasının üst ile aynı hizada sadece kadar yavaşça kafatası yoluyla iğne sürücü. Yine, bu fare kafatası inceliği nedeniyle yapılabilir. Z-koordinat sıfır, 1 mm / saniye (Şekil 3B) bir oranda -3.0 mm iğne düşük. Iğnenin mühür beyin için 2-3 dakika bekleyin. Saniyede 1 ul'lik bir oranda ASO tam 10 ul sağlar. 2-3 dakika bekleyin. Bu oran farklı ilaçlar arasında farklılık olsa Biz, ventrikül içine Asos için 1 ul infüzyon hızı kullanın. Çalışma sırasında,% 2.5 FastGreen Boya 10-20 ul sunarak iğne doğru yerleştirilmesi için kontrol edin. Boya infüzyon kısa bir süre sonra 1X PBS 0.03% heparin ile fare serpmek ve boya ventriküler sistemi (Şekil 3C) olduğunu doğrulamak için beynin koronal bölümleri yapmak. <li> iğne tabanında kafatası karşı bir pamuklu çubuk tutun. Saniyede 1 mm bir oranda iğne kaldırın. En kısa sürede iğne kafatası dışında olduğu gibi, iğne deliğinin üzerine pamuklu rulo ve dışarı sızmasını herhangi ASO önlemek için 1 dakika tutun. , Kapalı deri dikin antibiyotik merhem uygulamak, ve ısıtmalı kurtarma pad üzerinde yer fare. ASO konsantrasyonuna bağlı olarak, tamamen kurtarmak için birkaç saat için 20 dakika sürebilir. Sadece pompa implantasyonu gibi, ağrı / rahatsızlık ve enfeksiyon kontrol etmek için ameliyat sonrası günlük fareler izlemek. Gerekli gördüğü gibi Carprofen ve antibiyotik ile tedavi.