Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

El protocolo a continuación ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y Comités uso en la Universidad de Washington en St. Louis y está de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de experimentación. Si esta es la primera vez que la realización de cirugías, le recomendamos que consulte el artículo de Jove en cirugías de roedores como introducción antes de comenzar la 14. OSS se pueden entregar en el SNC a través del ratón tanto para la infusión de la bomba osmótica y una sola inyección en bolo ICV. Debido a esto, el procedimiento detallado a continuación se divide en dos segmentos. Pros y contras de cada método se abordaron en la sección de Discusión. Las coordenadas que se utiliza en los protocolos son para adultos y C57BL6 ratones B6C3. Coordenadas de rata correspondientes se pueden encontrar en la Tabla 1. Bomba osmótica ALZET 1. Preparación de bombas osmóticas Alzet Establecer un drap estérilcorreo y colocar cuidadosamente los siguientes elementos en ella, teniendo cuidado de no tocar nada directamente con el fin de mantener la esterilidad: bomba osmótica (s), modulador de flujo (s), 1 ml jeringa estéril (s), hoja de bisturí, y las secciones de tubería (1 pedazo de tubería = 5 bombas). Para los ratones, hay tres opciones para bombas: 14 días, 28 días y 42 días (Figura 2A). Destapar y llenar tubos cónicos estériles de 50 ml con 15 a 20 ml de solución salina. Hasta 6 bombas montadas se pueden añadir por tubo cónico. Llene un plato de Petri p60 con etanol al 100%. Añadir número apropiado de catéteres para el etanol. Para los ratones, longitud del catéter es de 2,5 mm. Filtrar cada ASO en tantos tubos Eppendorf de 1,5 ml, según sea necesario. Incluye un tubo de Eppendorf lleno con 0,9% de solución salina estéril para llenar el tubo con. Una vez que todo está preparado, se puso los guantes estériles. Asegúrese de no tocar nada que no sea estéril. Cámbiese los guantes si es necesario. Para cada ASO a ser utilizado, llenar una jeringa de 1 mly loadpumps mediante la colocación de la aguja en el orificio superior y llenar lentamente hasta que el exceso de fugas a cabo. Continúe hasta que todas las bombas están llenas. Destape el Flow-moduladores y se insertan en las bombas. Empuje el flujo de-modulador casi la totalidad de la forma en, dejando un espacio de 3-5 mm. Uso de la hoja de bisturí, corte cada pedazo de tubo en 5 segmentos iguales. Tome una pieza de tubo, llenar con solución salina estéril usando una jeringa de 1 ml, y insertar la parte superior del modulador de flujo en un extremo de la tubería. Luego tomar una cánula desde el etanol y conectarlo al otro extremo de la tubería. Ahora la bomba está completamente montado. Coloque la bomba completamente montada en el tubo cónico estéril de 50 ml con solución salina para el cebado. El cebado permite para las bombas para absorber fluido para iniciar la administración de fármacos, así como llegado a la temperatura adecuada. El tiempo de cebado: 14 bombas días: 06.04 h, 28 bombas de día: 40 hr, bombas de 42 días: 60 h. Cuando haya terminado el montaje de las bombas, tapar los tubos cónicos y colocar en un lugar limpio37 ° C baño de agua hasta la cirugía. 2. Procedimiento Pre-quirúrgica Limpie todo abajo con etanol al 70% para esterilizar la zona y establecer paños estériles sobre la mesa y stereotax para crear un campo estéril. Es importante tener en cuenta el campo estéril durante toda la cirugía completa. Active la siguiente: esterilizador de cuentas, cojín de calefacción, luz, lectura digital y de oxígeno / Sistema de isoflurano (Figura 1). Los siguientes elementos serán necesarios si hacerlo o bien una sola cirugía o un lote de cirugías, ya que habitualmente hacemos: 1 par de pinzas, 1 pinza hemostática curva, 1 par de tijeras pequeñas, 1 par de pequeñas tijeras romas curvas, 1 rata de corte del hueso , 1 pinza hemostática recta, 5-0 suturas de nylon, 1 tubos cónicos con etanol al 70%, 1 tubo cónico con etanol al 95%, 1 tubo cónico con yodo, 1 tubo cónico con peróxido de hidrógeno, el paquete de hisopos de algodón estériles, 1 botella de súper pegamento, 1 tubo de pomada antibiótica, 1 tubo de ojolubricante, y 1 máquina de afeitar eléctrica. Coloque la punta de los dos pares de tijeras, pinzas hemostáticas y curvado en el esterilizador de cuentas durante 15 s. Retirar y colocar en etanol al 70%. Cuando se realiza más de una cirugía, vuelva a esterilizar las puntas de los instrumentos en entre los animales. Girar el isoflurano al 4% y O 2 0,4 l / min y el flujo de gas directamente a la cámara. Contamos con nuestro sistema / oxígeno isoflurano calibrado al menos una vez al año para asegurarse de que estamos entregando la cantidad adecuada de anestesia. Coloque el ratón en la cámara y espere hasta que la respiración se ralentiza considerablemente. Retire el ratón y realice una pizca dedo del pie para asegurarse de que el ratón es completamente inconsciente. Afeitar el pelo de la parte superior del hombro hasta en medio de los ojos. Si el ratón comienza a despertar, coloque el puntero del ratón hacia la cámara hasta que el ratón es completamente inconsciente de nuevo, confirmando con una pizca dedo del pie. Coloque el ratón anestesiado en el stereotax y empuje el cono de la nariz sobre la nariz.Sea amable como los dientes y los huesos son frágiles. Dirigir el flujo de gas al stereotax mantener el ratón anestesiado. Es importante comprobar de vez en cuando para asegurarse de que el ratón es completamente inconsciente con una pizca dedo del pie durante toda la cirugía. Asegure la cabeza con los barrotes del oído. Nosotros preferimos nivelación bares del oído, aunque para apuntar el ventrículo lateral, un cráneo perfectamente nivel no es necesario debido al gran tamaño del ventrículo. Baje el nivel de isoflurano al 2,0% para el mantenimiento. Frote pomada en cada ojo. Como se ve en el video, había un campo estéril sobre el ratón de modo que sólo la base del cuello y la cabeza están expuestos. A continuación, la desinfección de la zona quirúrgica limpiando la parte superior de la cabeza y el cuello en un movimiento circular comenzando en el centro de la zona de afeitado y en movimiento hacia el exterior primero con un hisopo de algodón humedecido en etanol al 95%, seguido de un bastoncillo de algodón humedecido en yodo. Se recomienda utilizar una temperatura del sistema de calefacción de sonda rectal retroalimentación controlada que garantizala temperatura del ratón se mantiene en un establo 37 ° C. Si la temperatura del ratón disminuye durante la cirugía, la recuperación después de la cirugía puede llevar más tiempo y la hipotermia resultante puede conducir a la actividad aberrante de proteínas, incluyendo la hiperfosforilación de la proteína Tau asociada a microtúbulos 15. Después de configurar el sistema de calefacción, que ahora está listo para comenzar la cirugía. 3. Implantación de la bomba osmótica Alzet Antes de comenzar la cirugía, se puso un nuevo par de guantes estériles. Luego, utilizando fórceps y un pequeño par de tijeras, hacer una incisión en la piel de la base del cuello por encima de cráneo del animal a un máximo en entre los ojos Tome las tijeras romas con la curva hacia arriba y deslice por debajo de la piel en la base de la parte posterior del cuello hacia la extremidad posterior izquierda. No debería haber ninguna resistencia. Si existe, retire las tijeras y vuelva a intentarlo. Esto forma el bolsillo subcutáneo de la bomba osmótica. Wipe el cráneo limpio con hisopos de algodón estériles, seguido de un bastoncillo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno para mejorar la bregma. Limpiar abajo de los tubos cónicos de 50 ml que contienen bombas para mantener la esterilidad de las bombas. Con cuidado, una bomba desde el tubo cónico utilizando la pinza hemostática curva, teniendo cuidado de que la bomba no toca los lados del tubo cónico. Mantenga la base de la bomba con unas pinzas y empuje el modulador de flujo en el resto de la forma con la pinza hemostática curva. Mantenga la bomba donde el modulador de flujo y el tubo se reúnen con la pinza hemostática curva. Inserte la bomba bajo la piel en la base del cuello y empujarlo hacia la extremidad posterior izquierda hasta el tope sin resistencia. Tenga cuidado de no dejar que la sonda toque nada. Con la pinza hemostática curva, tomar la cánula en la ranura de la parte superior, donde se encuentra con el pedestal. Mueva el controlador de la cánula en su posición y asegure en su lugar. Coloca una gota de pegamento en la base de la cánula. Push la parte superior de la cánula en el conductor y la posición de modo que el tubo se apunta directamente hacia atrás. Toque la punta del catéter a bregma y poner a cero las coordenadas en la pantalla digital. Elevar el catéter y mover 1,1 mm lateralmente a la derecha y 0,5 mm posterior (Figura 2B). Mantenga la piel de la manera con la pinza hemostática curva. Conducir el catéter de metal delgado a través del cráneo hasta que la base cánula de plástico quede presionado firmemente contra la parte superior del cráneo. El catéter de metal se puede conducir directamente a través del cráneo en ratones debido al cráneo delgada relativa. Si el uso de ratas, perforar un agujero en el cráneo antes de bajar el catéter. Tire cualquier piel que tiene pegamento en la basura del cráneo. Con el controlador cánula que sostiene la cánula / sonda en su lugar, esperar 1-2 minutos para que el pegamento se seque completamente. Durante la práctica, para evaluar la colocación del catéter, se inyectan 20-40 l de 2,5% FastGreen colorante a través del tubo (Figura 2C). Espere 2-3 minutos, perfuse el ratón con 1X PBS 0,03% heparina, y retire el cerebro. Corte coronal en el sitio del catéter. Si el catéter se coloca en el ventrículo, el colorante se perfunde en todo el sistema ventricular del ratón (Figura 2D). Sostenga el catéter en su lugar con la pinza hemostática curva mientras que aumentaba el conductor. Suelte lentamente la pinza para asegurarse de que la cánula está bien fijado al cráneo. Con un hisopo de algodón, presione hacia abajo la parte superior de la cánula. Coloque a los Clippers ósea de rata en el bosque entre la parte superior y la base de la cánula. Clip de la parte superior de la cánula mientras sigue presionando hacia abajo con el bastoncillo de algodón. Trata de mantener el nivel de las podadoras para no separar la cánula del cráneo. Si la cánula no vengas arrastrado, de forma rápida re-pegamento y aplique presión con un hisopo de algodón durante 2 min. Usando el hilo de sutura 5-0, hemostática regular, y las pinzas, suturas a lo largo de la apertura total, prestando una atención especial a la derecha sobre la cánula. Utilizamos un running sutura de colchonero horizontal (véase la figura 5) debido a la incisión más grande sobre el cráneo. Aplique una pequeña cantidad de pomada antibiótica en la cabeza y el cuello. Afloje el oído bares y aflojar el cono de la nariz. Retire el ratón del stereotax y colóquelo en una almohadilla térmica para la recuperación. Monitorear los ratones estrechamente para la duración de la recuperación, típicamente van desde 10-30 minutos. Compruebe cada 2-3 minutos hasta que el ratón comienza a caminar alrededor y que se prepara. 4. Cuidados después de la operación Controle los ratones al día después de la cirugía para la primera semana. Si un ratón parece estar en el dolor o la angustia, le recomendamos que proporciona el ratón con un mg / kg por inyección subcutánea de 5 Carprofen una vez cada 24 horas durante un máximo de 5 días, a fin de aliviar el dolor. Si parece que hay una infección, aplicar generosamente pomada antibiótica a la zona a diario y consultar con un veterinario a cargo para asegurar que la herida se cura adecuadamente. ReMove la sutura de nylon 5-0 7-10 días después de la cirugía para prevenir la irritación del hilo de sutura. 5. Cambio o eliminación de la bomba osmótica Alzet Después de la bomba se realiza la infusión activamente ASO, se puede ya sea cambiado o eliminado por completo. Siga el mismo procedimiento antes de la cirugía mencionado, con las siguientes modificaciones: 1) no se necesitan las tijeras curvas, hemostática curva, cortadores ósea de rata, ni la pantalla digital, y 2) en lugar de preparar la cabeza del ratón, afeitarse y desinfectar la parte posterior del ratón en el cruce de la bomba y la tubería. Hacer una incisión de 1,5 cm en la parte posterior del ratón, perpendicular a la unión de la bomba / tubo, utilizando fórceps y tijeras. Saque con cuidado la bomba fuera de la incisión sin tirar / empujar la tubería ya que podría sacudir el catéter de manera significativa. Para quitar la bomba, cortar el tubo aproximadamente 0,5 cm por encima del modulador de flujo y toque el pegamento al tubo to sellarlo. Espere 1-2 minutos para que el pegamento se seque. Colocar el tubo nuevamente dentro de la incisión y sutura cerrada. Frote ungüento antibiótico sobre la piel suturada y el lugar del ratón sobre una almohadilla de recuperación climatizada. Para cambiar la bomba, recién han hecho bombas listo junto con un plato de 10 cm llena con etanol al 95%. Los catéteres no son necesarios con las nuevas bombas. Agarra una nueva bomba con las pinzas. Sumerja sus dedos en el etanol, echa mano de la bomba, y desechar el flujo modulador. Luego, con cuidado y lentamente salga de la bomba vieja del modulador de flujo conectado al tubo y la cánula. Tan pronto como está apagado, deslice lentamente la nueva bomba en, asegurando que el modulador de flujo nunca toca la parte exterior del ratón. Vuelva a introducir la nueva bomba a través de la incisión de nuevo en el paquete subcutánea y la sutura de la piel. Frote ungüento antibiótico sobre la herida y el lugar del ratón en la pista de la recuperación. Al igual que con la implantación de la bomba, supervisar los ratones todos los días después de la cirugía para comprobar si pain / malestar e infecciones. Tratar con Carprofen y los antibióticos cuando se considere necesario. ICV BOLO 6. Procedimiento Pre-quirúrgica Siga el mismo procedimiento antes de la cirugía como en la sección 2 anterior con los siguientes cambios: 1) no se necesitan tijeras curvas, hemostática curva, o cuchillas de hueso de rata, 2) limpiar una jeringa Hamilton 10 l y la aguja con agua esterilizada y se carga con ASO, y 3) conectar la jeringa y la aguja en el aparato estereotáxico donde se encuentra el controlador cánula. 7. Inyección en bolo de ASO Con unas pinzas y un pequeño par de tijeras, hacer una incisión en la base del cuello hasta en medio de los ojos. Limpiar el cráneo limpio con hisopos de algodón estériles, seguido de un bastoncillo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno para mejorar la bregma. Mueva la jeringa / aguja en su lugar y fijarla. Asegúrese de que la parte biselada de la aguja se enfrenta posterior. Bajela aguja hasta que toque bregma. Poner a cero todas las coordenadas. Mover la aguja lateralmente hacia la derecha 1,0 mm anterior y 0,3 mm (Figura 3A). Maneje lentamente la aguja a través del cráneo justo hasta que el agujero de la aguja quede al ras con la parte superior del cráneo. Una vez más, esto se puede hacer debido a la delgadez del cráneo del ratón. El cero de la coordenada z y bajar la aguja a -3,0 mm a una velocidad de 1 mm / seg (Figura 3B). Espere 2-3 minutos para el cerebro para sellar alrededor de la aguja. Entregar el 10 l lleno de ASO a una velocidad de 1 l por seg. Espere 2-3 minutos. Utilizamos una tasa de infusión de l 1 de OSS en el ventrículo, aunque esta tasa puede variar entre los diferentes fármacos. Durante la práctica, comprobar la correcta colocación de la aguja mediante la entrega de 10 a 20 l de 2,5% FastGreen Dye. Perfundir el ratón con 1X PBS 0,03% de heparina pronto después de la infusión del tinte y hacer que las secciones coronales del cerebro para verificar que el tinte se encuentra en el sistema ventricular (Figura 3C). <li> Mantenga una torunda de algodón contra el cráneo en la base de la aguja. Levante la aguja a una velocidad de 1 mm por seg. Tan pronto como la aguja está fuera del cráneo, rodar el hisopo de algodón sobre el agujero de la aguja y mantener durante 1 min para evitar la ASO se escape. Suturar la piel se cerró, aplique ungüento antibiótico, y el lugar del ratón en la pista de la recuperación climatizada. Dependiendo de la concentración de ASO, puede tardar 20 minutos para un par de horas para recuperarse por completo. Al igual que con la implantación de la bomba, supervisar los ratones todos los días después de la cirugía para revisar para el dolor / incomodidad y las infecciones. Tratar con Carprofen y los antibióticos cuando se considere necesario.