Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Le protocole ci-dessous a été approuvé par l'Institutional Animal Care et comités utilisation à l'Université Washington à St Louis et est en conformité avec les Instituts de lignes directrices de Santé pour l'utilisation des animaux de laboratoire national. Si c'est votre première fois, des opérations chirurgicales, nous vous conseillons d'examiner l'article JoVE sur les chirurgies de rongeurs en guise d'introduction avant de commencer 14. OSS peuvent être livrés à la CNS de souris à la fois par perfusion de la pompe osmotique et une injection en bolus unique ICV. Pour cette raison, la procédure décrite ci-dessous est divisée en deux segments. Avantages et inconvénients de chaque méthode seront abordés dans la section Discussion. Les coordonnées utilisées dans les protocoles sont pour adultes C57BL6 et B6C3 souris. Coordonnées correspondantes de rat peuvent être trouvés dans le tableau 1. Pompe osmotique ALZET 1. Préparation des pompes osmotiques Alzet Fixer un drap stérilee et déposez soigneusement les éléments suivants sur elle tout en prenant soin de ne pas toucher directement quelque chose pour maintenir la stérilité: pompe osmotique (s), le débit modulateur (s), 1 ml seringue stérile (s), lame de scalpel, et des sections de tubes (1 morceau de tube = 5 pompes). Pour les souris, il ya trois options pour les pompes: 14 jours, 28 jours et 42 jours (figure 2A). Déboucher et remplir tubes coniques de 50 ml stériles avec une solution saline ml 15-20. Jusqu'à 6 pompes assemblées peuvent être ajoutés par tube conique. Remplir un plat p60 Petri avec de l'éthanol à 100%. Ajoutez nombre approprié de cathéters à l'éthanol. Pour les souris, la longueur du cathéter est de 2,5 mm. Filtrer chaque ASO en autant de tubes Eppendorf de 1,5 ml, si nécessaire. Inclure un tube Eppendorf stérile rempli de solution saline 0,9% pour remplir le tube avec. Une fois que tout est prêt, mettre des gants stériles. Assurez-vous de ne pas toucher tout ce qui n'est pas stérile. Changer de gants si nécessaire. Pour chaque ASO à être utilisé, remplir une seringue de 1 mlet loadpumps en plaçant l'aiguille dans le trou supérieur et en remplissant lentement jusqu'à l'excès s'échappe. Continuez jusqu'à ce que toutes les pompes sont remplis. Déboucher le Flow-modulateurs et l'insérer dans les pompes. Poussez le flux modulateur quasi-totalité de la manière, en laissant un espace de 3-5 mm. Utilisation de la lame de scalpel, couper chaque morceau de tube en 5 segments égaux. Prenez un morceau de tube, remplir avec du sérum physiologique stérile en utilisant une seringue de 1 ml, et insérez le haut du modulateur de débit dans une extrémité de la tubulure. Ensuite, prendre une canule à partir de l'éthanol et de le connecter à l'autre extrémité de la tubulure. La pompe est maintenant entièrement assemblé. Placez la pompe complètement montée dans le tube conique stérile de 50 ml avec une solution saline pour l'amorçage. L'amorçage permet aux pompes pour s'imprégner de liquide pour amorcer la livraison de la drogue ainsi que venir à la bonne température. temps d'amorçage: 14 pompes à jour: 4-6 h, 28 pompes à jour: 40 h, 42 pompes à jour: 60 h. Lorsque vous avez terminé le montage des pompes, plafonner les tubes coniques et les placer dans un endroit propre37 ° C bain d'eau jusqu'à ce que la chirurgie. 2. Procédure de pré-chirurgicale Tout essuyer avec 70% d'éthanol pour stériliser la région et établir des draps stériles sur le dessus de table et stereotax pour créer un champ stérile. Il est important de tenir compte du champ stérile pendant toute la chirurgie. Allumez le suivant: stérilisateur à billes, plaquettes de chauffage, lumière, affichage numérique et de l'oxygène / System isoflurane (Figure 1). Les éléments suivants seront nécessaires si cela soit une simple intervention chirurgicale ou tout un lot de chirurgies comme nous le faisons régulièrement: 1 paire de pinces, 1 pince hémostatique courbe, 1 paire de petits ciseaux, 1 paire de petits ciseaux émoussés courbes, 1 rat coupe d'os , 1 pince hémostatique droite, 5-0 fils de nylon, 1 tubes coniques avec 70% d'éthanol, 1 tube conique avec de l'éthanol à 95%, 1 tube conique avec de l'iode, 1 tube conique avec du peroxyde d'hydrogène, paquet de cotons-tiges stériles, 1 bouteille de super colle, 1 tube de pommade antibiotique, 1 tube de l'œilun lubrifiant, et une rasoir électrique. Placez les pointes des deux paires de ciseaux, pinces, et hémostatique courbe dans le stérilisateur à billes pendant 15 secondes. Retirer et placer dans l'éthanol à 70%. Lorsque vous effectuez plus d'une intervention chirurgicale, re-stériliser les pointes des instruments entre les animaux. Tourner la isoflurane à 4% et de O 2 à 0,4 l / min et le débit de gaz directement vers la chambre. Nous avons notre système oxygène / isoflurane étalonné au moins une fois par an pour s'assurer que nous fournissons la quantité appropriée de l'anesthésie. Placez la souris dans la chambre et d'attendre jusqu'à ce que la respiration est considérablement ralenti. Retirez la souris et effectuer un pincement de l'orteil pour assurer la souris est complètement inconscient. Raser les poils de la partie supérieure de l'épaule jusqu'à entre les yeux. Si la souris commence à se réveiller, placez la souris de nouveau dans la chambre jusqu'à ce que la souris est complètement inconscient de nouveau, confirmant avec un pincement de l'orteil. Placez la souris anesthésiée sur le stereotax et pousser le cône de nez sur le nez.Soyez doux comme les dents et les os sont fragiles. Diriger le flux de gaz vers le stereotax pour maintenir la souris anesthésiées. Il est important de vérifier de temps en temps pour s'assurer que la souris est complètement inconscient avec un pincement de l'orteil tout au long de l'opération. Fixer la tête avec les barres d'oreilles. Nous préférons nivellement barres d'oreilles, mais de cibler le ventricule latéral, un crâne parfaitement de niveau n'est pas nécessaire en raison de la grande taille du ventricule. Tournez le niveau isoflurane en baisse à 2,0% pour l'entretien. Dab pommade sur chaque œil. Comme on le voit dans la vidéo, mettre un champ stérile sur la souris de sorte que seule la base du cou et la tête sont exposés. Puis désinfectez la zone chirurgicale en essuyant le sommet de la tête et du cou dans un mouvement circulaire en partant du centre de la zone rasée et vers l'extérieur premières avec un coton-tige trempé dans de l'éthanol à 95%, suivie par un coton-tige trempé dans de l'iode en mouvement. Nous vous recommandons d'utiliser un système de sonde rectale de retour à température contrôlée de chauffage qui assurela température de la souris reste à un niveau stable 37 ° C. Si la température de la souris diminue au cours de la chirurgie, le rétablissement post-opératoire peut prendre plus de temps et l'hypothermie résulte peut conduire à l'activité de la protéine aberrante, y compris hyperphosphorylation de la protéine Tau associée aux microtubules 15. Après la mise en place du système de chauffage, vous êtes maintenant prêt à commencer l'opération. 3. Implantation de pompe osmotique Alzet Avant de commencer l'opération, mettre sur une nouvelle paire de gants stériles. Ensuite, l'aide de pinces et d'une petite paire de ciseaux, faire une incision dans la peau de la base du cou au-dessus du crâne de l'animal à un maximum entre les yeux Prenez les ciseaux émoussés avec la courbe vers le haut et glisser sous la peau à la base du dos du cou vers le membre postérieur gauche. Il devrait y avoir aucune résistance. Si c'est le cas, enlever les ciseaux et essayez à nouveau. Cela constitue la poche sous-cutanée de la pompe osmotique. Wipe le crâne propre avec des cotons-tiges stériles, suivie d'un coton-tige trempé dans du peroxyde d'hydrogène pour améliorer bregma. Essuyer les 50 ml tubes coniques qui contiennent des pompes pour maintenir la stérilité de la pompe. Prendre soin d'une pompe du tube conique en utilisant la pince hémostatique courbe, en prenant soin supplémentaire que la pompe ne touche pas les parois du tube conique. Maintenir la base de la pompe avec une pince et enfoncez le modulateur de débit dans le reste de la voie avec la pince hémostatique courbe. Maintenez la pompe où le modulateur et tubes flux rencontrer la pince hémostatique courbe. Introduire la pompe sous la peau à la base du cou et de le repousser vers le membre postérieur gauche aussi loin qu'il peut aller sans résistance. Soyez prudent de ne pas laisser toucher quoi que ce soit du cathéter. Avec la pince hémostatique courbe, prenez la canule à la gorge, où le sommet se réunit le piédestal. Déplacez le conducteur canule en place et fixez en place. Placez une seule goutte de super glue sur la base de la canule. Push en haut de la canule dans le pilote et la position de sorte que le tube est pointé vers l'arrière. Touchez l'extrémité du cathéter à bregma et zéro les coordonnées sur l'écran numérique. Soulever et déplacer le cathéter de 1,1 mm latéralement vers la droite et de 0,5 mm en arrière (figure 2B). Maintenez la peau de la route avec la pince hémostatique courbe. Pousser la sonde métallique mince à travers le crâne jusqu'à ce que le fond de la canule en matière plastique est bien pressé contre le sommet du crâne. Le cathéter de métal peut être conduit directement à travers le crâne chez la souris en raison du crâne mince relative. Si vous utilisez des rats, percer un trou dans le crâne avant d'abaisser le cathéter. Retirez toute la peau qui a de la colle sur l'éloigner du crâne. Avec le pilote canule tenant la canule / cathéter en place, attendre 1-2 minutes pour que la colle sécher complètement. Lors de la pratique, afin d'évaluer la pose du cathéter, injecter ul 20-40 de 2,5% Dye FastGreen travers le tube (figure 2C). Attendez 2-3 min, perfuse la souris avec du PBS 1X 0,03% héparine, et enlever le cerveau. Couper coronaire au niveau du site de cathéter. Si le cathéter a été placé dans le ventricule, le colorant sera perfusée dans le système ventriculaire de la souris (figure 2D). Maintenir le cathéter en place avec la pince hémostatique courbe tout en augmentant le conducteur. Relâchez doucement la pince hémostatique pour s'assurer que la canule est correctement fixé sur le crâne. Avec un coton-tige, appuyez sur le haut de la canule. Monter les tondeuses osseuse de rat dans le bosquet entre le sommet et la base de la canule. Coupez le haut de la canule tout en appuyant avec le coton-tige. Essayez de garder le niveau de coupe afin de ne pas détacher la canule du crâne. Si la canule ne se décolle, rapidement re-colle et appliquer une pression avec un coton-tige pour 2 min de plus. Utilisation du fil de suture 5-0, hémostatique régulière, et forceps, suture le long de l'ouverture complète, en accordant une attention particulière à droite sur la canule. Nous utilisons un Running horizontal suture matelas (voir figure 5) en raison de la plus grande incision sur le crâne. Appliquer une noisette de pommade antibiotique sur la tête et le cou. Dévissez les bars de l'oreille et desserrer le cône de nez. Débranchez la souris de l'stereotax et les placer sur un coussin chauffant pour la récupération. Surveiller étroitement les souris pendant toute la durée de la récupération, allant généralement de 10-30 minutes. Consultez toutes les 2-3 minutes jusqu'à ce que la souris commence à marcher autour et se toiletter. 4. Soins post-opératoires Surveiller les souris quotidiens après la chirurgie pour la première semaine. Si une souris semble être dans la douleur ou de détresse, nous recommandons de prévoir la souris avec un mg / kg par injection sous-cutanée de 5 Carprofen une fois tous les 24 heures pour 5 jours afin de soulager la douleur. Si il semble y avoir une infection, appliquez généreusement une pommade antibiotique à la zone jour et consulter un vétérinaire traitant pour s'assurer que la plaie se cicatrise correctement. REDéplacez le fil de nylon 5-0 7-10 jours après la chirurgie pour éviter l'irritation de fil de suture. 5. Modification ou suppression pompe osmotique Alzet Après la pompe se fait infuser activement ASO, il peut être modifié ou complètement enlevé. Suivez la même procédure pré-opératoire que ci-dessus avec les modifications suivantes: 1) vous n'aurez pas besoin de ciseaux courbes, hémostatique courbe, coupe osseuse de rat, ni l'affichage numérique, et 2) à la place d'apprêter la tête de la souris, le rasage ou l' désinfecter le dos de la souris, à la jonction de la pompe et la tubulure. Faire une incision cm 1.5 à l'arrière de la souris, perpendiculaire à la jonction pompe / tuyau, l'aide de pinces et de ciseaux. Retirez soigneusement la pompe hors de l'incision sans tirer de façon significative / poussant sur le tube que cela puisse ébranler le cathéter. Pour retirer la pompe, couper le tuyau d'environ 0,5 cm au-dessus du modulateur de débit et de toucher la colle au tube to joint la fermer. Attendez 1-2 min pour que la colle sèche. Remettre le tube dans l'incision et suture fermée. Dab onguent antibiotique sur la peau suturée et le lieu de la souris sur un tapis de récupération chauffée. Pour changer la pompe, sont fraîchement préparés pompes prête aussi d'un plat de 10 cm remplie par de l'éthanol à 95%. Les cathéters sont pas nécessaires avec les nouvelles pompes. Prenez une nouvelle pompe avec la pince. Trempez vos doigts dans de l'éthanol, s'emparer de la pompe, et jeter le flux modulateur. Puis, lentement et avec précaution retirer l'ancienne pompe à partir du modulateur de débit fixé à la tubulure et de la canule. Dès qu'il est éteint, faites glisser lentement la nouvelle pompe, veiller à ce que le modulateur de débit ne touche jamais à l'extérieur de la souris. Remettez la nouvelle pompe à travers l'incision de nouveau dans le paquet sous-cutanée et suture la peau. Dab onguent antibiotique sur la plaie et le lieu souris sur le bloc de récupération. Tout comme avec l'implantation de la pompe, contrôler les souris tous les jours après l'opération pour vérifier pain / inconfort et infections. Traiter avec Carprofen et des antibiotiques lorsque cela est jugé nécessaire. ICV BOLUS 6. Procédure de pré-chirurgicale Suivez la même procédure de pré-chirurgie de l'article 2 ci-dessus avec les modifications suivantes: 1) vous n'aurez pas besoin de ciseaux courbes, hémostatique courbe ou des couteaux en os de rat; 2) Nettoyez à 10 ul seringue Hamilton et l'aiguille avec de l'eau stérilisée et charge avec ASO et 3) fixer la seringue et l'aiguille de l'appareil de stéréotaxie où se trouvait le conducteur canule. Sept. Injection d'un bolus d'ASO En utilisant des pinces et une petite paire de ciseaux, faire une incision de la base du cou jusqu'à entre les yeux. Essuyez le crâne propre avec des cotons-tiges stériles, suivie d'un coton-tige trempé dans du peroxyde d'hydrogène pour améliorer bregma. Déplacez la seringue / aiguille en place et le fixer. Assurez-vous que la partie biseautée de l'aiguille face postérieure. Baissezl'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche bregma. Zéro toutes les coordonnées. Déplacer l'aiguille latéralement vers la droite 1,0 mm et 0,3 mm antérieur (figure 3A). Conduisez lentement l'aiguille dans le crâne jusqu'à ce que le trou de l'aiguille est aligné sur le haut du crâne. Encore une fois, cela peut être fait en raison de la minceur du crâne de la souris. Zéro la coordonnée z et abaisser l'aiguille à -3,0 mm à une vitesse de 1 mm / s (figure 3B). Attendez 2-3 min pour le cerveau pour sceller autour de l'aiguille. Livrer le plein 10 pi de ASO à un taux de 1 pl par seconde. Attendez 2-3 min. Nous utilisons un ul débit de perfusion 1 pour OLS dans le ventricule, mais ce taux peut varier entre différents médicaments. Lors de la pratique, vérifier le bon positionnement de l'aiguille en livrant 10-20 ul de 2,5% Dye FastGreen. Perfuser la souris avec du PBS 1X 0,03% héparine peu après perfusion de colorant et de faire des coupes coronales du cerveau afin de vérifier que le colorant se trouve dans le système ventriculaire (figure 3C). <li> Maintenir un coton-tige sur le crâne à la base de l'aiguille. Relever l'aiguille à une vitesse de 1 mm par seconde. Dès que l'aiguille est en dehors de la boîte crânienne, rouler le coton-tige sur le trou de l'aiguille et maintenir pendant 1 minute afin d'éviter toute fuite de ASO. Suturer la peau fermé, appliquer un onguent antibiotique, et le lieu souris sur le bloc de récupération chauffée. Selon concentration ASO, il peut prendre 20 min pour quelques heures pour se remettre complètement. Tout comme avec l'implantation de la pompe, contrôler les souris tous les jours après l'opération pour vérifier la douleur / gêne et les infections. Traiter avec Carprofen et des antibiotiques lorsque cela est jugé nécessaire.