<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar
Summary
Citrobacter rodentium enfeksiyonu enterik bakteriyel enfeksiyonlar çalışma yanı sıra farelerde bağışıklık yanıtları ve kolit barındırmak için değerli bir model sunar. Bu protokol bariyer bütünlüğünü, patojen yük ve murin infeksiyöz kolit patojen ve konak katkıların tam karakterizasyonu izin histolojik hasar ölçümü özetliyor.
Abstract
Bu protokol, bulaşıcı hastalığı ve ülseratif sağlam bir model üretmek için gerekli adımları, aynı zamanda farelerdeki Citrobacter rodentium enfeksiyon karakterize etmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. C. rodentium yakından klinik olarak önemli insan patojenleri enteropatojenik E. ile ilgili bir gram negatif, murin spesifik bakteriyel patojen coli ve Enterohemorrhagic E. coli. C ile bulaştıktan sonra rodentium, bağışıklık fareler mütevazı ve geçici kilo kaybı ve ishal muzdarip. Histolojik olarak, bağırsak kript uzama, bağışıklık hücre infiltrasyonu ve goblet hücre tükenmesi gözlenmektedir. Enfeksiyon Açıklık 3-4 hafta sonra elde edilir. Enfeksiyonu sonrası farklı zaman noktalarında intestinal epitel bariyeri bütünlüğünün, bakteri yükü ve histolojik hasarın ölçülmesi, enfeksiyona karşı duyarlı fare suşlarının karakterizasyonu izin verir.
Virülans mekanizmasıs bakteriyel patojenler onların ana yanı sıra, bu tür enfeksiyonlara karşı savunma özel ana yanıtların bağırsak kolonize olan göre tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, C. enterik bakteriyel enfeksiyon rodentium modeli bu süreçleri anlamamıza yardım etmek için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Enterik bakteriler de İnflamatuvar Bağırsak Hastalıkları (İnlamatuar bağırsak) ile bağlantılı olmuştur. Bu İBH hastalarında görülen uyumsuz kronik enflamatuvar yanıtları enterik bakteriler intestinal mukozal bağışıklık sisteminin anormal maruz kaldıktan sonra genetik olarak yatkın kişilerde gelişir olduğu öne sürülmektedir. Bu nedenle, enfeksiyöz kolit modelleri çalışmada enterik bakterilerin potansiyel patojen konakçı tepkileri tanımlamak için önemli bir potansiyel sunmaktadır. C. rodentium indüklenen kolit İBH patogenezinde potansiyel mekanizmaları hakkındaki bilgilerimizi geliştirerek, enterik bakterilerin konak yanıtların analizi için olanak sağlayan bir tür nadir bir modeldir;yeni önleyici ve terapötik tedavilerinin geliştirilmesi önemlidir.
Introduction
Enterik bakteriyel patojenler tarafından Enfeksiyon gastrointestinal (Gİ) iltihabı yanı sıra, ishal ve intestinal epitel bariyeri disfonksiyonu dahil intestinal patoloji ve patofizyolojisi, tetikler. Bakteriyel patojenler kendi hosts, yanı sıra enfeksiyonlara karşı savunmak belirli bir host yanıtların gastrointestinal kolonize hangi virülans mekanizmalar yeterince anlaşılmamaktadır, enterik bakteriyel enfeksiyonların modellemede Ancak son gelişmeler bu süreçleri anlamamıza yardım etmeye başlamışlardır. Enterik bakteriler de İnflamatuvar Bağırsak Hastalıkları (İnlamatuar bağırsak) ile bağlantılı olmuştur. İnlamatuar bağırsak Crohn Hastalığı (CD) ve UC kronik intestinal inflamasyon ve doku hasarı ile karakterize etyolojisi bilinmeyen karmaşık hastalıklar vardır. Böyle dekstran sodyum sülfat (DSS) ve d gibi bileşikler, kimyasal sorunlara, fareler – / – bağırsak iltihabı birçok fare modelleri, IL10 gibi genetiği değiştirilmiş suşları, spontan inflamasyon, mevcutinitrobenzene sülfonik asit (DNBS) 1. Bu İBH hastalarında mevcut uyumsuz kronik enflamatuvar yanıtları enterik bakteriler intestinal mukozal bağışıklık sisteminin anormal pozlama 2, bu nedenle bulaşıcı kolit modelleri çalışma aynı zamanda potansiyel patojen konak tanımlanması için önemli bir potansiyel sunmaktadır üzerine genetik olarak yatkın kişilerde gelişir olduğu öne sürülmüştür . enterik bakteriler yanıtları Citrobacter rodentium indüklenen kolit enterik bakteriler ve İBH patogenezinde olası mekanizmaların daha iyi anlaşılması için ev sahibi yanıtların analizi için izin de 1,3 karakterize edilmiştir infeksiyöz kolit ender modellerden biridir; önemli bir adım yeni önleyici ve iyileştirici tedavileri geliştirmek.
C. rodentium yakından önemli insan ile ilgili bir (A / D) gram takılarak negatif ve effacing, murin spesifik bakteriyel patojenpatojenler enteropatojenik E. coli (EPEC) ve enterohemorajik E. coli (EHEC) 3-8. A / E patojenlerin ailesi yakından konak hücre üzerinde bir non-invaziv kaide-benzeri bir yapı oluşturan, çekal ve kolonik epitelin apikal konak hücre zarının eklemek. C. ile Oral meydan 10 8 -10 9 organizmaların rodentium kript, mononükleer immün hücre infiltrasyonu ve goblet hücre tükenmesi 3,4 kolon hiperplazi veya uzaması ile karakterize enfeksiyöz kolit sağlam bir model üretir. Kolonizasyon ilk site, birkaç saat uyarımı sonrası, çekal yama az 2 ila 3 gün enfeksiyon sonra 3 distal kolon ilerleme takip etmektedir. Immünkompetan fare suşları olarak, patojen temizlenmesi 3 ila 4 hafta enfeksiyon 1,3,4 sonra elde edilir. Bununla birlikte, birçok genetik olarak değiştirilmiş suşları, örneğin gen eksik veya nakavt (- / -) farelerde önemli ölçüde artar göstermek için tespit edilmiştirabartılı hasar ve / veya kronik enfeksiyon ve inflamasyon 9-14 sonuçlanan enfeksiyona yatkınlık sed. Bu nakavt suşları bu infeksiyöz kolit modelinde kullanılması, doğuştan gelen sinyal proteinlerin eksik çok, bağırsak enfeksiyonu ve inflamasyonu çözünürlüğü ayrılmaz birkaç ana proteinlerin açığa vazgeçilmez olmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium enfeksiyon hastalığı ve farelerde kolit hem de çalışma için değerli bir model sağlamaktadır. Bu özgün model hem konakçı tepkileri, bakteriler gibi patojenik özellikleri karakterizasyonu için olanak sağlar. Adımlar bu protokolü detaylı olarak bu modelin başarılı kullanımı sıraladı.
Kolit ve yanıtları analiz ederken akılda tutulması gereken bu protokolü birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, bir gece boyunca taze C ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Crohn ve Kanada Kolit Vakfı (CCFC) ve Sağlık Araştırması (CIHR) için Kanada Enstitüleri BAK için işletim bağışları ile desteklenmiştir. GB CIHR mezun öğrencilikle tarafından finanse edildi. BAV Bağırsak ve Karaciğer Hastalıkları (ÇOCUK) Pediatrik Gastroenteroloji Pediatrik İBH Araştırma ve Kanada Araştırma Başkanı Vakfı Başkanı olan çocuklar olduğunu.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
