<em> Citrobacter rodentium</em> דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק
Summary
זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לייצר מודל חזק של מחלה מדבקת וקוליטיס, כמו גם את השיטות כדי לאפיין Citrobacter זיהום rodentium בעכברים. ג rodentium הוא הפתוגן גרם שלילי, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לחשיבות קלינית האנושי פתוגנים enteropathogenic E. coli וenterohemorrhagic E. coli. עם ההידבקות בג עכברי rodentium, immunocompetent סובלים מירידה במשקל צנוע וחולפת ושלשולים. ביסטולוגיה, התארכות מעי קריפטה, חדירה לתא חיסוני, ודלדול תא גביע הם נצפו. חיסול של זיהום מושג לאחר 3 עד 4 שבועות. מדידה של יושרת מעי אפיתל מכשול, עומס חיידקים, וניזק היסטולוגית בנקודתי זמן שונים לאחר הדבקה, מאפשרת אפיון של זני עכברים רגישים לזיהום.
מנגנון הארסיותזה שבו חיידקים פתוגנים ליישב את המעי של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב. לכן ג מודל rodentium של זיהום חיידקי enteric משמש ככלי חשוב כדי לסייע בהבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי ראתה בחולי IBD לפתח אצל אנשים רגישים גנטיים לאחר חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric. לכן, המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל תגובות מארחות פתוגניים לחיידקי enteric. ג rodentium המושרית קוליטיס היא דגם נדיר אחד כזה שמאפשר ניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric, קידום ההבנה של מנגנונים אפשריים של IBD פתוגנזה שלנו;חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.
Introduction
זיהום על ידי חיידקים פתוגנים enteric מעורר דלקת במערכת עיכול (GI), כמו גם פתולוגיה במעיים ופתופיזיולוגיה, כולל שלשולים ובעיות בתפקוד מחסום אפיתל במעי. המנגנונים הארסיים שבו חיידקים פתוגנים ליישב במערכת העיכול של מארחיהם, כמו גם תגובות מארחות ספציפיות המגנות מפני זיהומים כאלה הם הבינו היטב, אך ההתקדמות האחרונה בדוגמנות של זיהומים חיידקיים enteric החלה לסייע להבנה של תהליכים אלה שלנו. חיידקי enteric נקשר גם למחל מעי דלקתיות (IBDs). המחלות של IBDs קרוהן (CD) והאוניברסיטה קליפורניה הן מחלות מורכבות של מסיבות לא ברור, המתאפיינות בדלקת מעיים כרוניות וניזק לרקמות. מודלי עכבר רבים של דלקת מעיים קיימים, מדלקת ספונטנית בזנים מהונדסים גנטי, כגון IL10 – / – עכברים, לאתגרים עם תרכובות כימיים, כגון נתרן גופרתי dextran (DSS) ודinitrobenzene חומצת sulfonic (DNBS) 1. זה כבר שער שהתגובה הדלקתית הכרונית הסתגלותי בהווה בחולי IBD לפתח באנשים רגישים גנטי עם חשיפה לא תקינה של מערכת החיסון ברירית המעי לחיידקי enteric 2, ולכן המחקר של מודלים של קוליטיס המדבק גם מציע פוטנציאל משמעותי להגדרת פוטנציאל מארח פתוגניים . תגובות לחיידקי enteric Citrobacter rodentium המושרה קוליטיס היא האחד הדגמים הנדירים של קוליטיס המדבק שכבר אפיינו 1,3 היטב, ומאפשרים לניתוח של תגובות מארחות לחיידקי enteric והבנה נוספת של מנגנונים אפשריים של היווצרות מחלת מעי דלקתי; צעד חיוני בפיתוח טיפולים מונעים וטיפוליים חדשניים.
ג rodentium הוא מצרף גרם שלילי והשתפשפות (/ E) הפתוגן, עכברי ספציפי חיידקים הקשור באופן הדוק לאדם החשובפתוגנים enteropathogenic E. coli (EPEC) וenterohaemorrhagic E. coli (EHEC) 3-8. משפחתו של פתוגנים / E אינטימית לצרף קרום התא המארח הקודקוד של האפיתל cecal ומעי גס, ויצרה מבנה לא פולשנית דום דמוי בתא הפונדקאי. אתגר אוראלי עם ג rodentium של 10 8 -10 9 אורגניזמים מייצר דגם חזק של קוליטיס המדבק מתאפיין היפרפלזיה או התארכות מעי של מאורות, חדירה לתא חיסוני mononuclear וירידה בכמות תאי גביע 3,4. האתר הראשוני של קולוניזציה, כמה שעות אחרי אתגר, הוא בתיקון cecal, ואחרי התקדמות למעי גס דיסטלי 2 עד 3 ימים לאחר ההדבקה 3. בזני עכברי immunocompetent, אישור של הפתוגן מושגת 3 עד 4 שבועות לאחר ההדבקה 1,3,4. עם זאת, זנים רבים מהונדסים גנטי, כלומר גן לקוי או נוקאאוט (- / -) עכברים, נמצא להצגת increased רגישות לזיהום וכתוצאה מכך לניזק מוגזם ו / או דלקת ודלקת כרונית 9-14. השימוש במודל זה קוליטיס המדבק בנוקאאוט הזנים האלה, חסרי חלבוני איתות מולדות רבות, היה הכרחי בחושפים כמה חלבונים מארחים אינטגרליים לרזולוציה של זיהום ודלקת מעיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר לחקר מחלות וקוליטיס בעכברים מדבקים. מודל ייחודי זה מאפשר אפיון של שתי התגובות המארחות, כמו גם את התכונות של חיידקים פתוגניים. השלבים מתוארים בפירוט בפרוטוקול זה שימוש המוצלח של דגם זה.
ישנם מס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים תפעוליים BAV מקרוהן וקוליטיס קרן של קנדה (CCFC) והמכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). GB מומן על ידי מלגת לימודים לתואר שנייה מCIHR. BAV הוא הילדים עם הפרעות מעיים וכבדים (ילד) יו"ר קרן לחקר מחלת מעי דלקתי בילדים וקנדה מחקר קתדרת הילדים גסטרואנטרולוגיה.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
