ال<em> الليمونية rodentium</em> نموذج الفأر: دراسة العوامل الممرضة والمضيفة المساهمات في التهاب القولون المعدية
Summary
الليمونية rodentium العدوى يوفر نموذجا قيما لدراسة الالتهابات البكتيرية المعوية وكذلك استضافة الاستجابات المناعية والتهاب القولون في الفئران. هذا البروتوكول يحدد قياس سلامة الحاجز، تحميل الممرض والأضرار النسيجية السماح للتوصيف دقيق للمساهمات الممرض والمضيف لالتهاب القولون المعدية الفئران.
Abstract
هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لإنتاج نموذج قوي من الأمراض المعدية والتهاب القولون، وكذلك الطرق المستخدمة لوصف الليمونية العدوى rodentium في الفئران. C. rodentium هو، سلبية الغرام الفئران محددة الممرض البكتيرية التي ترتبط ارتباطا وثيقا الهامة سريريا الإنسان E. ممرض للأمعاء مسببات الأمراض كولاي E. وenterohemorrhagic القولونية. على الإصابة بفيروس C. rodentium والفئران مناعيا يعانون من فقدان الوزن متواضعة وعابرة والإسهال. تشريحيا، ويلاحظ المعوية سرداب استطالة، تسلل خلية المناعة، والقدح استنفاد الخلايا. ويتحقق إزالة العدوى بعد 3 إلى 4 أسابيع. قياس الأمعاء الظهارية سلامة الحاجز، الحمل البكتيري، والأضرار النسيجية في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة، والسماح للتوصيف سلالات الفئران عرضة للإصابة.
ضراوة آليةS من مسببات الأمراض البكتيرية التي تستعمر الأمعاء من مضيفيهم، وكذلك الردود التي تدافع عن المضيف محددة ضد الالتهابات مثل هذه غير مفهومة تماما. لذا C. نموذج rodentium من العدوى البكتيرية المعوية بمثابة أداة قيمة للمساعدة في فهمنا لهذه العمليات. كما تم البكتيريا المعوية المرتبطة أمراض التهاب الأمعاء (IBDs). فقد تم الافتراض أن الاستجابات الالتهابية المزمنة غير القادرة على التأقلم ينظر في المرضى الذين يعانون IBD تطوير الأفراد عرضة وراثيا في أعقاب التعرض غير طبيعي في نظام المناعة المخاطية المعوية للبكتيريا المعوية. ولذلك، فإن دراسة نماذج من التهاب القولون المعدية يتيح إمكانات كبيرة لتحديد الاستجابات المحتملة المسببة للأمراض المضيفة للبكتيريا المعوية. C. rodentium الناجم عن التهاب القولون هو نموذج واحد نادرة بحيث يسمح لتحليل استجابات المضيف للبكتيريا المعوية، وتعزيز فهمنا للآليات المرضية المحتملة لIBD؛أساسيا في تطوير علاجات وقائية من الرواية والعلاجية.
Introduction
العدوى عن طريق مسببات الأمراض البكتيرية المعوية المعدية المعوية يتسبب (GI) التهاب، وكذلك الأمراض المعوية والفيزيولوجيا المرضية، بما في ذلك الإسهال والأمعاء الظهارية ضعف الجدار. ولا يزال الغموض يكتنف آليات الفوعة من مسببات الأمراض البكتيرية التي استعمار الجهاز الهضمي من مضيفيهم، وكذلك الردود التي تدافع عن المضيف محددة ضد الالتهابات مثل هذه، بدأت التطورات الحديثة في النمذجة ومع ذلك من الالتهابات البكتيرية المعوية لمساعدتنا على فهم هذه العمليات. كما تم البكتيريا المعوية المرتبطة أمراض التهاب الأمعاء (IBDs). مرض كرون في IBDs (CD) وUC هي أمراض معقدة من مرض غير معروف، يتميز التهاب الأمعاء المزمن وتلف الأنسجة. نماذج الماوس العديد من الالتهابات المعوية موجودة، من التهاب عفوية في سلالات معدلة وراثيا، مثل IL10 – / – الفئران، لمواجهة التحديات مع المركبات الكيميائية، مثل كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) ودinitrobenzene حمض السلفونيك (DNBS) 1. فقد تم الافتراض أن الاستجابات الالتهابية المزمنة غير القادرة على التأقلم موجودة في المرضى IBD تطوير الأفراد في وراثيا عرضة عند التعرض غير طبيعي في نظام المناعة المخاطية المعوية للبكتيريا المعوية 2، ولذلك دراسة نماذج من التهاب القولون المعدية كما يقدم إمكانية كبيرة لتحديد المضيف المحتمل المسببة للأمراض . الردود على البكتيريا المعوية التي يسببها التهاب القولون rodentium الليمونية هي واحدة من النماذج النادرة من التهاب القولون المعدية التي تميزت جيدا 1،3، مما يسمح لتحليل استجابات المضيف للبكتيريا المعوية وزيادة فهم الآليات المحتملة من IBD المرضية؛ خطوة أساسية في تطوير علاجات وقائية الرواية والعلاجية.
C. rodentium هو، سلبية الغرام إرفاق الفئران والأضواء (A / E) الممرض محددة البكتيرية التي ترتبط ارتباطا وثيقا البشرية الهامةممرض للأمعاء مسببات الأمراض E. القولونية (EPEC) E. والمعوى كولاي (EHEC) 3-8. عائلة A مسببات الأمراض / E إرفاق ارتباطا وثيقا غشاء الخلية المضيفة القمي من ظهارة الأعور والقولون، وتشكيل غير الغازية مثل هيكل التمثال على الخلية المضيفة. عن طريق الفم مع التحدي C. rodentium من الكائنات الحية 8 9 10 -10 تنتج نموذجا قويا من التهاب القولون المعدية التي تتميز تضخم القولون أو استطالة للالخبايا، وحيدات النوى تسلل خلية المناعة، والقدح استنفاد الخلايا 3،4. الموقع الأولي للاستعمار، بعد ساعات قليلة من التحدي، هو في التصحيح الأعور، يليه التقدم إلى القولون البعيدة 2 إلى 3 أيام بعد الإصابة 3. في سلالات الفئران مناعيا، ويتحقق إزالة مسببات المرض 3 إلى 4 أسابيع بعد الإصابة 1،3،4. ومع ذلك، العديد من سلالات معدلة وراثيا، أي الجينات ناقصة أو خروج المغلوب وقد وجد الفئران، لعرض increa (- / -)الحوار الاقتصادي الاستراتيجي أكثر عرضة للإصابة مما أدى إلى أضرار مبالغ فيها و / أو عدوى مزمنة والتهاب 9-14. استخدام هذا النموذج التهاب القولون المعدية في هذه السلالات خروج المغلوب، وكثير تفتقر الفطرية البروتينات مما يشير، وقد تم الكشف عن البروتينات لا غنى عنها في عدة المضيف جزءا لا يتجزأ من القرار العدوى المعوية والالتهابات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الليمونية rodentium العدوى يوفر نموذجا قيما لدراسة كل الأمراض المعدية والتهاب القولون في الفئران. هذا النموذج الفريد يسمح لتوصيف كل من الاستجابات المضيفة، فضلا عن الخصائص المسببة للأمراض من البكتيريا. حدد الخطوات في هذا التفصيل بروتوكول نجاح استخدام هذا النموذج. </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة التشغيل لBAV من كرون والتهاب القولون مؤسسة كندا (CCFC) والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR). وقد تم تمويل GB من قبل منحة دراسية عليا من CIHR. BAV هو الأطفال الذين يعانون من الاضطرابات المعوية والكبد (الطفل) رئيس مؤسسة البحوث IBD الأطفال وكرسي أبحاث أمراض الجهاز الهضمي للأطفال في كندا.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
