O<em> Citrobacter rodentium</em> Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa
Summary
Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.
Abstract
Este protocolo descreve os passos necessários para a produção de um modelo robusto de doença infecciosa e colite, bem como os métodos utilizados para caracterizar Citrobacter rodentium infecção em ratinhos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa, patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com a importância clínica humana patógenos enteropatogênica E. coli entero-e E. coli. Após a infecção com C. rodentium, ratos imunocompetentes sofrem de perda de peso modesta e transitória e diarréia. Histologicamente, alongamento cripta intestinal, infiltração de células imunes, e depleção de células caliciformes são observados. Eliminação da infecção é conseguida ao fim de 3 a 4 semanas. Medição da integridade da barreira epitelial intestinal, a carga bacteriana, ou de lesões histológicas em diferentes momentos após a infecção, permitiu a caracterização de estirpes de ratinho susceptíveis à infecção.
O mecanismo de virulências por agentes patogénicos bacterianos, que colonizam o tracto intestinal de hospedeiros, bem como as respostas específicas de acolhimento que defendem contra essas infecções são pouco compreendidos. Por conseguinte, a C. rodentium modelo de infecção bacteriana entérica serve como uma ferramenta valiosa para ajudar a nossa compreensão desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Postula-se que as respostas inflamatórias crónicas adaptativos observados em pacientes com DII desenvolver, em indivíduos geneticamente susceptíveis, após a exposição anormal do sistema imune da mucosa intestinal de bactérias entéricas. Assim, o estudo de modelos de colite infecciosa oferece um potencial significativo para a definição de respostas do hospedeiro potencialmente patogénicos em bactérias entéricas. C. rodentium colite induzida é um tal modelo raro que permite a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas, promovendo a nossa compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD;essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.
Introduction
Infecção por agentes patogénicos bacterianos entéricos desencadeia a inflamação gastrointestinal (GI), bem como a patologia do intestino e fisiopatologia, incluindo a diarreia e disfunção da barreira epitelial intestinal. Os mecanismos de virulência de patógenos bacterianos que colonizam o trato gastrointestinal de seus hospedeiros, bem como respostas de acolhimento específicas que defendem contra essas infecções são mal compreendidos, no entanto avanços recentes na modelagem de infecções bacterianas entéricas começaram a ajudar o nosso entendimento desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Doença de Crohn IBDS (CD) e UC são doenças complexas de etiologia desconhecida, caracterizada pela inflamação intestinal crônica e dano tecidual. Muitos modelos de rato de inflamação intestinal existe, a partir de inflamação espontânea em estirpes geneticamente modificados, tais como a IL-10 – / – de ratos, aos desafios químicos com os compostos, tais como o sulfato de sódio de dextrano (DSS) e dinitrobenzene sulfico (DNBS) 1. Há a hipótese de que os desajustados respostas inflamatórias crônicas presentes em pacientes com DII desenvolver em indivíduos geneticamente susceptíveis após a exposição anormal do sistema imunológico da mucosa intestinal de bactérias entéricas 2, portanto, o estudo de modelos de colite infecciosa também oferece um potencial significativo para definir potencialmente patogênica anfitrião . respostas a bactérias entéricas Citrobacter rodentium colite induzida é um dos modelos de colite infecciosa raras que tem sido bem caracterizados 1,3, permitindo a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas e uma maior compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD, um passo essencial no desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.
C. rodentium é uma bactéria gram negativa e anexando effacing (A / E), patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com o humano importantepatógenos enteropatogênica E. coli (EPEC) e E. enterohemorrágicas coli (EHEC) 3-8. A família de agentes patogénicos A / E intimamente anexar à membrana apical da célula hospedeira do epitélio do ceco e do cólon, formação de uma estrutura não-invasivo pedestal semelhante sobre a célula hospedeira. Desafio oral com C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produz um modelo robusto de colite infecciosa caracterizada por hiperplasia do cólon ou alongamento das criptas, infiltração de células mononucleares imunológico e esgotamento das células caliciformes 3,4. O sítio inicial da colonização, algumas horas após o desafio, é no remendo cecal, seguido de progressão para o cólon distai 2 a 3 dias após a infecção 3. Em estirpes de murganhos imunocompetentes, a depuração do agente patogénico é alcançado 3 a 4 semanas após a infecção 1,3,4. No entanto, muitas estirpes geneticamente modificados, ou seja deficiente ou gene knockout (- / -), ratinhos, foram encontrados para exibir aumensed susceptibilidade à infecção, resultando em danos exagerados e / ou infecção crónica e inflamação 9-14. A utilização deste modelo de colite infecciosa nessas estirpes knockout, muitas proteínas de sinalização deficiente inatas, tem sido indispensável para revelar proteínas hospedeiras várias integrais para a resolução da infecção e inflamação intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de doenças infecciosas tanto em ratos e colite. Este modelo único permite a caracterização de ambas as respostas do hospedeiro, bem como as propriedades patogénicas de bactérias. As etapas descritas neste detalhe o protocolo de uso bem sucedido desse modelo.
Há vários passos críticos neste protocolo para manter em mente quando induzir colite e analisar as respostas. Em primeiro lugar, a prepara?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento para BAV da Fundação de Crohn e Colite do Canadá (CCFC) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). GB foi financiado por uma bolsa de estudo de pós-graduação a partir de CIHR. BAV é a crianças com distúrbios intestinais e do Fígado (filho) Cadeira Fundação de Pesquisa IBD Pediátrica e do Presidente de Pesquisa do Canadá em Gastroenterologia Pediátrica.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
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