La<em> Citrobacter rodentium</emModèle de souris>: Étudier Contributions des agents pathogènes et l'hôte de la colite infectieuse
Summary
Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude des infections bactériennes entériques ainsi que l'hôte réponses immunitaires et la colite chez la souris. Ce protocole décrit la mesure du intégrité de la barrière, la charge de pathogènes et les dommages histologiques permettant la caractérisation approfondie des contributions pathogène et de l'hôte à la colite infectieuse murin.
Abstract
Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour produire un modèle robuste d'une maladie infectieuse et la colite, ainsi que les méthodes utilisées pour caractériser l'infection Citrobacter rodentium chez la souris. C. rodentium est une gram négatif, murin pathogène spécifique bactérienne qui est étroitement liée à l'importance clinique humaine entéropathogène pathogènes E. coli entérohémorragique et E. coli. Lors de l'infection à C. rodentium, souris immunocompétentes souffrent de la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Histologiquement, l'allongement crypte intestinale, l'infiltration de cellules immunitaires, et l'épuisement des cellules caliciformes sont observées. Garde d'infection est atteinte après 3 à 4 semaines. Mesure de l'intégrité barrière épithéliale intestinale, la charge bactérienne, et les dommages histologiques à différents moments après l'infection, permettent la caractérisation des souches de souris sensibles à l'infection.
Le mécanisme de virulences par des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l'hôte qui défendent contre de telles infections sont mal compris. Par conséquent, le C. rodentium modèle d'infection bactérienne entérique constitue un outil précieux pour aider à la compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Il a été émis l'hypothèse que les réponses inflammatoires chroniques inadaptés observés chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles après une exposition anormale du système immunitaire intestinal des muqueuses à des bactéries entériques. Par conséquent, l'étude des modèles de colite infectieuse offre un potentiel important pour la définition potentiellement pathogènes réponse de l'hôte aux bactéries entériques. C. rodentium colite induite est un modèle du genre rare qui permet l'analyse des réponses de l'hôte aux bactéries entériques, approfondir notre compréhension des mécanismes potentiels de la pathogenèse du commerce international;essentiel dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.
Introduction
L'infection par des bactéries pathogènes entériques déclenche gastro-intestinal (GI) l'inflammation, ainsi que pathologie intestinale et la physiopathologie, y compris la diarrhée intestinale et dysfonction de la barrière épithéliale. Les mécanismes de virulence des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus gastro-intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l'hôte qui défendent contre de telles infections sont mal comprises, mais les progrès récents dans la modélisation des infections entériques bactériennes ont commencé à nous aider dans notre compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Maladie de Crohn Le MII (CD) et UC sont des maladies complexes d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation intestinale chronique et des lésions tissulaires. De nombreux modèles murins d'inflammation intestinale existent, d'une inflammation spontanée des souches génétiquement modifiés, tels que l'IL10 – / – souris, aux défis chimiques avec des composés tels que le sulfate de dextrane sodique (DSS) et dinitrobenzene sulfonique (DNBS) 1. Il a été émis l'hypothèse que les réponses inadaptées chroniques inflammatoires présentes chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles à l'exposition anormale du système immunitaire intestinal muqueuse de bactéries entériques 2, donc l'étude des modèles de colite infectieuse offre également un potentiel important pour la définition de l'hôte potentiellement pathogène . réponses à des bactéries entériques Citrobacter rodentium colite induite est l'un des rares modèles de colite infectieuse qui a été bien caractérisés 1,3, ce qui permet l'analyse des réponses de l'hôte aux bactéries entériques et de la compréhension de nouveaux mécanismes potentiels de la pathogenèse de MICI, une étape essentielle dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.
C. rodentium est une gram négatif attachant et effaçant (A / E), murin pathogène bactérien spécifique qui est étroitement liée à l'humain importantentéropathogène pathogènes E. coli (EPEC) et entérohémorragique E. coli (EHEC) 3-8. La famille d'un des agents pathogènes / E intimement joindre à la membrane de la cellule hôte apicale de l'épithélium du caecum et du côlon, la formation d'un non-invasive piédestal structure en forme de la cellule hôte. Provocation par voie orale avec C. rodentium de 10 8 -10 9 organismes produisant un modèle robuste d'une colite infectieuse caractérisée par une hyperplasie du côlon ou de l'allongement des cryptes, infiltration mononucléaire cellules immunitaires et l'épuisement des cellules caliciformes 3,4. Le site initial de la colonisation, quelques heures après la provocation, est le patch du caecum, suivie par une progression dans le côlon distal 2 à 3 jours après l'infection 3. Dans souches de souris immunocompétentes, l'élimination de l'agent pathogène est atteinte 3 à 4 semaines après l'infection 1,3,4. Cependant, de nombreuses souches génétiquement modifiés, c.-à-gène déficient ou KO (- / -) des souris, ont été trouvés pour afficher augsed susceptibilité à l'infection causant des dommages exagérés et / ou d'une infection chronique et l'inflammation 9-14. L'utilisation de ce modèle de colite infectieuse chez ces souches huitièmes de finale, beaucoup manquent innées protéines de signalisation, a été indispensable pour révéler plusieurs protéines de l'hôte faisant partie intégrante de la résolution de l'infection et de l'inflammation intestinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude de deux maladies infectieuses et de la colite chez la souris. Ce modèle unique permet de caractériser des réponses de l'hôte, ainsi que les propriétés pathogènes de bactéries. Les étapes décrites dans ce protocole détail l'utilisation réussie de ce modèle.
Il ya plusieurs étapes critiques de ce protocole à garder à l'esprit lors de l'induction de colite et de l'analys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement aux BAV de la maladie de Crohn et la colite Foundation of Canada (CCFC) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Go a été financée par une bourse d'études supérieures des IRSC. BAV sont les enfants souffrant de troubles intestinaux et du foie (ENFANT) Président de la Fondation de la recherche sur les MII de pédiatrie et la Chaire de recherche du Canada en gastroentérologie pédiatrique.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
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