Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma

1. Seçimi ve Tarama Gönüllü Sağlıklı gönüllüler NHS Araştırma ve Etik Komitesi yönlendirmeleri doğrultusunda, reklam afişleri aracılığıyla ve üniversite web sitesinde işe alınırlar. Katılım için dahil edilme kriterleri şunlardır: 18-60 yaş arası yetişkinler. Akıcı İngilizce konuşuyor ve mobil telefon ve kısa mesaj hem kolayca iletişim kurabilmektedir. Katılım için dışlama kriterleri şunlardır: Riskli bireyler (çocuklar, bağışıklık sistemi baskılanmış yetişkinler, yaşlılar, kronik hastalık) de yakın temas. Halen içen veya önemli sigara öyküsü (> 10 paket-yıl). Astım ya da diğer solunum hastalığı. Gebelik. Penisilin veya amoksisilin alerji. Gözlemsel sürece veya girişimsel olmayan faz bir başka klinik çalışmada Mevcut tutulumu. Tamamen bilgilendirilmiş rıza açılamıyor. Bir ilk eleme ziyareti, yaklaşık bir hafta inokülasyon öncesinde, odaklanmış bir klinik öykü ve hedeflenen klinik muayene içerir. Önceden tanınmayan bir anormallik bulunursa, gönüllü çalışmaya dahil edilecek ve uygun soruşturma birincil bakım yoluyla düzenlenecektir. Ilk tarama sırasında beyaz küre sayısı inokülasyon ziyaretten önce normal sınırlar içinde olmasını sağlamak için alınan bir tam kan sayımı ziyaret edin. Bir nazal yıkama (6.1) doğal pnömokok taşıyıcıları dışlamak için yapılır. Inokülasyon öncesinde, gönüllü çalışmaya katılımı ile riskleri üzerinde eğitimli ve acil hasta broşür, dijital termometre, acil telefon numaraları ve amoksisilin 3 günlük kurs ile sağlanır. 2. Aşılama Hisse hazırlanması Inokülasyon stoklarının hazırlanması temiz bir ortamda yapılmalıdır. Kullanılan pipetler sadece kullanmak gerekirinokülum hazırlanması için d. Tüm cam ve plastik eşya steril olmalıdır. Biz inokülasyon stokları adanmış fumehood ve inkübatör kullanarak, özel bir odada hazırlanmalıdır öneririz. Pnömokok suşları bir kan agar plağına inoküle edilir. Plakalar% 5 CO2 içinde gece boyunca 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Aşağıdaki gün tüm bakterilerin kan agar plaka koparılmış ve bir boncuk stok koruma sistemi içine inoküle edilir. Bunlar boncuk stokları inokülasyon stoku hazırlanması için kullanılır. Bir aşı stoku hazırlamadan önce kontaminasyon ve koloni tekdüzelik için boncuk stokları sınayın. Inokülasyon stok hazırlamak için tüm plaka kapsayacak şekilde çizgiler, istenen pnömokok serotipi boncuk stok iki boncuk ile bir kan agar plağına inoküle edin. 2 gece boyunca% 5 CO içinde 37 ° C 'de plakaları inkübe edin. Bütün ileri inkübasyonlar bu aynı koşullar kullanacaktır. Ayrıca kısırlık sağlamak için gecede Vegitone medya kuluçkaya yatmaktadır. Ertesi sabah çubuklayarım tabak, dikkat çekici herhangi bir kan agar çıkarın ve önceden ısıtılmış Vegitone suyu 12 ml eklemek değildir. Plaka diğer yarısını kullanarak tekrarlayın. Bulanıklık değişikliği belirgin hale gelinceye kadar 2 saat veya 37 ° C'de iki 12 ml şişe bırak, hangisi önce gelirse. Önceden ısıtılmış Vegitone suyu 40 ml 12 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer 12 ml flakon için tekrarlayın. Bu sefer noktası = 0'dır. 600 nm'de optik yoğunluk (OD) okuma 100 ul çıkarın. Miles ve Misra (M & M) 7 tarafından yöntemin bir varyasyonunu kullanıyor koloni oluşturan birim (CFU) sayısı ile bakteri ölçümü için 20 ul çıkarın. Her iki flakon inkübe edin. M & M için altı bölüme bir kan agar bölün. 96 plaka altı kuyularının (U-alt) için steril PBS 180 ul ekleyin. Iyi iyi ve karıştırmak için suyu 20 ul ekleyin. Seri numune 01:10 altı kez sulandırmak ve altıncı kuyudan 20 ul atın. Ilk bölüme iyi yanı Sıra üç 10 ul damlakan agar plaka. Diğer beş kuyu için tekrarlayın. Terslenir ve inkübe önce plaka kuru olduğundan emin olun. Ertesi gün her seyreltme bölüm ve kayıtlarında görülmesi kolonilerin sayısını saymak. , 30 ve 300 arasında bir sayı ile seyreltme bölümünü kullanarak bir ortalama elde etmek için üç tarafından görünür kolonilerin sayısı bölün. Seyreltme faktörü ile kolonilerin ortalama sayısını çarpın ve sonra 10 (10 ul damla miktarı) bölün. Bu ul / CFU verir. CFU / ml almak için 1,000 bu sayı çarpın. Erken, orta-log fazı, 0,25 OD ulaşılıncaya kadar M & M yöntemi her saat OD 600 okumalar ve bakteri ölçümü gerçekleştirin. Bu OD ulaşıldığında, bir şişe sterilize% 10 gliserol ekleyin ve 1 ml alikotları hazırlamak. -80 Mağaza alikotları ° C Bir daha konsantre stok için, 15 dakika boyunca 3,345 x g de santrifüj diğer şişeye ve süpernatan çıkarın. Vegiton 22.5 ml pelet yeniden süspanse edinE orta ve% 10 gliserol ilave edin. -80 1 ml alikotları ve mağaza hazırlayın ° C. Çözülme ve miktarının önce en az 48 saat boyunca -80 ° C'de stokları bırakın. M & M yöntemi ile dondurulmuş bakteriyel stok sayısal. Tekrarlanabilirlik sağlamak için ayrı ayrı üç stok tüpleri sınayın. Aşağıda açıklandığı gibi, tuzlu su ile istenen konsantrasyona inokulum stok sulandırmak için elde edilen değerini kullanın. , Bir aşılama için, inokulum içerisinde pnömokok miktar inokülasyondan önce ve sonra hesaplanır. M & M yöntemi ile bakteri bu miktar da tüm prosedürü tamamlamak için gereken süreyi hesapları inokulum içerisinde pnömokok ortalama sayısını belirlemek için kullanılır. Bir inokulum hazırlanması istenilen konsantrasyona seyreltilmesi ve "ön-inokülasyon" saymak için M & M yöntemi ile ölçümü gerçekleştirin. Bizim Klinik Araştırma Tesisi yılında tüm aşılama prosedürünü tamamlamak için takım 30 dakika sürer. Pnsalin içinde eumococcal süspansiyonlar genellikle bu aralıkta bir azalma sayısını gösterir. Bu hesap için, 30 dakika için oda sıcaklığında seyreltilmiş inokulum bekletin ve sonra M & M yöntem ile bakterilerin bir "post-aşılama" ölçümü gerçekleştirmek. Nihai inoküle konsantrasyonunu belirlemek için önce ve sonra, ortalama al. Klinik protokolüne göre "oturma" zamanı ayarlayın ama mümkün olduğunca kısa süre tutun. Tüm yeni hisse senedi stoku saflık ve kimlik doğrulama için bir referans laboratuvara gönderilmesi gerekmektedir. 3. İnokulum Hazırlık Inokulum hazırlanması planlanan gönüllü inokülasyon randevu 30 dakika önce başlamalıdır. -80 ° C dondurucu önceden yapılmış stok tüplerinden biri çıkar, çözülme ve 3 dakika boyunca 17.000 xg'de mikrosantrifüj yılında tüp dönerler. 37 ° C inkübatör Sıcak kanlı agar plaklarına. HazırlamakBir 96 M & M yöntemi ile bakteri ölçümü için plaka ve istenilen doza göre seyreltme tüpleri hazırlayın. Santrifüje tüp suyu süpernatantı ve tuzlu su, 1 ml pelet tekrar süspansiyon. Bu adım, inokulum gelen suyu kaldırır. Santrifüj basamağı tekrarlayın. Tuzlu süpernatantı ve tuzlu su, 1 ml pelet tekrar süspansiyon. İstediğiniz inokulum konsantrasyonu dilüsyon set yapın ve M & M yöntemi ile ölçmek. Gönüllü randevuya inokulum atın ve gönüllüler inokülasyon sonrasında, laboratuarda ölçümü tekrarlayın. -80 Tarih ve inokulum dozu ve mağaza ile tüp etiketleyin ° C. Inokülasyon gelen inokülasyon tutarlılık sağlamak için, aynı pipetler ve özel laboratuvar ekipmanı her zaman kullanmak önemlidir. 4. Aşılama Gönüllüler bir yarı yatar pozisyonda rahatça oturmuş olmalıdır. <li> Bir P200 pipet kullanarak ve steril filtre ipuçları inokulum 100 ul hazırlar ve sadece burun boşluğunun içine ucu takın. Yavaşça dairesel hareketlerle kullanarak nazal mukoza üzerine inokulum sınırdışı. Bu pipet ucu kan dolaşımına giren bakteriler neden olabilir epitelinin bütünlüğünün bozulması gibi burun mukozası ile temas olmadığı önemlidir. Bu inokülum çok geriye yerleştirilmiş olması veya boğazına çalışacağını da çok önemlidir, bu nazal kavite içinde bulunması gerekir. Diğer Naris için tekrarlayın. Gönüllü burun koklama veya üfleme olmadan 10 dakika yarı yatar pozisyonda kalır mı. Bu bakteriler için zaman mukozaya boyunca dağıtmak için izin verir. 5. İzleme Gönüllüler aşılanmasını takiben günlük olarak takip edilmektedir. Bu 2 pm önce araştırmacılara gönüllü tarafından gönderilen günlük bir metin mesajı içerir. Eğer metin is gönüllü onun / onu refahı sağlamak için sizinle temasa geçecektir öğleden sonra saat 2'de alınmadı. O / o yanıt vermezse, akrabası tahsis yanındaki gönüllünün refahını sağlamak için sizinle temasa geçecektir. Gönüllüler her randevu herhangi bir üst solunum yolu semptomları rapor istenir. Klinik personeli onun / onu belirtileri tanımlamak için gönüllü soracaktır ve herhangi bir şikayetleri takip edecektir. Gönüllüler için antibiyotikler üç koşullar altına alınması için sadece vardır; onlar hasta ve bunların çalışma sonunda pnömokok taşıma, ya da hasta eğer varsa, araştırma ekibi tarafından bunu yapması için talimat olması durumunda, ve araştırma ekibi iletişim kuramadı. Gönüllü çalışma sırasında her zaman onlarla bu acil paketi tutmak için teşvik edilir ve sonraki 7 gün için günlük bazda araştırma ekibi ile irtibata geçmeleri rica edilir. Ekibimiz ho üzerinden mesai saatlerinde hemşire kişiyle 7/24 mevcuttur ve iki doktor mevcuttururs. Tüm sorgular telefon ve / veya derhal gözden tarafından ele alınmaktadır. Gerekirse Karşılıklar, bir Enfeksiyon Hastalıkları servisinde anında, doğrudan kabul için kullanılabilir. 6. Burun yıkama (KB) Prosedür Burun yıkamaları (NW), bir başlangıç ​​tarama ziyaret yanı sıra, 48 saat, 7 ve 14 gün aşılama sonrası gerçekleştirilir. Ikinci KB yöntem Naclerio et al alınmıştır. 8 Gönüllüler doğal olarak S. tarafından kolonize pneumoniae aşılama dışında ve takip edilmektedir. Gönüllü rahatça oturduğundan ve kafası dikey geri 30 ° eğilir. Derin bir nefes alın ve ağız çatı karşı geriye kendi dil yukarı itip ederken nefeslerini tutmak için gönüllü değildir. Bu pozisyonda iken, gönüllü onlar hazır olduğunu işaret etmesi istenir. 20 ml tuzlu su ile doldurulmuş bir şırınga ön burun boşluğuna yerleştirilir ve tuzlu 5 ml dışarı atılır. Volunteer sonra hemen öne doğru eğilir ve bir folyo kaseye burundan hızla exhaling tarafından sıvı dışarı atar. Bu işlem her Naris iki kez yıkanmış ve tam 20 ml kullanılır olmuştur böylece 3 kez daha tekrarlayın. Bir santrifüj tüpü içinde bir arada Havuz tüm örnekler ve işleme için oda sıcaklığında laboratuvar için gönderir. 7. Burun yıkama İşleme 3,345 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. -80 Etiketli Eppendorf tüplerine 1 ml alikotları gibi süpernatant ve mağaza kaldırın ° C Pelet orta 9 STGG 100 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Bu noktada tüp içinde toplam hacmi belirlendi olduğundan emin olun. Bu seyreltme, bir taşıma pozitif NW CFU hesaplanmasında kullanılır. Plaka gentamisin ve çizgi tüm plaka içeren bir kan agar plaka üzerine yeniden süspanse pelet içeren STGG bir 20 ul damla. NW aşılama sonrası ise, Yeniden süspanse pelet ve M & M yöntemi ile bakteri ölçümü için kullanılmasını içeren STGG 10 ul çıkarın. NW tüp STGG başka 800 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Tüm plağı çizgiler bir kan agar ve çikolata agar plaka üzerine 25 ul üzerine Tabak 25 ul,. -80 2 kriyotüplerin ve mağaza içine orta STGG asılı kalan miktar bakteri Böl ° C. % 5 CO2 içinde 37 ° C de bir gece de plakaları inkübe edin. Plakaları pnömokok ve diğer potansiyel solunum patojenleri için ertesi gün inceleyin. Pnömokok koloni morfolojisi ile plakalar üzerinde tanımlanır. Ressam morfolojiye sahip Alfa hemolitik koloniler bir optokine diski ile kan agara alt-kültür ve gece inkübe. Optokine duyarlı Presumptive pnömokok koloniler Gram Gram pozitif diplokoklar onaylamak için lekeli ve Statens Serum Institut Pneu kullanarak serotiplendirilmiştir edilirmotest-Lateks kiti.