תובלת pneumococcal אנוש ניסויית

1. התנדבות בחירה והקרנה מתנדבים בריאים מגויסים באמצעות מודעות וכרזות באתר האוניברסיטה לפי NHS המחקר והדרכת ועדת אתיקה. את הקריטריונים להכללת השתתפות הם: מבוגרים בגילים 18-60 שנים. מדבר אנגלית רהוטה, והוא מסוגל לתקשר בקלות על ידי שני טלפונים סלולריים והודעות טקסט. את קריטריוני הפסילה להשתתפות הם: קשר הדוק עם אנשים בסיכון (ילדים, מבוגרי immunosuppressed, בריאות קשישים, כרונית חולה). היסטוריה הנוכחית מעשנים או משמעותי מעישון (> 10 שנתי חפיסה). אסטמה או מחלה נשימתית אחרת. הריון. אלרגיה לפניצילין או אמוקסיצילין. מעורבות שוטפת בניסוי קליני נוסף, אלא אם כן תצפית או בשלב שאינו התערבותית. אין אפשרות לתת הסכמה מהדעת באופן מלא. ביקור סינון ראשוני, כשבוע לפני החיסון, כולל היסטוריה קלינית ממוקדת ובדיקה קלינית ממוקדת. אם חריגות מוכרות קודם לכן נמצאה, מתנדבים יהיה נכללו במחקר והחקירה המתאימה תהיה מסודרת דרך טיפול ראשוני. במהלך הסינון הראשוני לבקר ספירת דם מלאה מתקבלת כדי להבטיח שספירת התאים הלבנה נמצאת בטווח נורמלי לפני ביקור החיסון. שטיפת אף מבוצעת כדי לשלול נישאים pneumococcal טבעי (ראה 6.1). לפני החיסון, מתנדב מתחנכים על הסיכונים כרוכים בהשתתפות במחקר ומסופקים עם כרוז חירום מטופל, מדחום דיגיטלי, מספרי טלפון לשעת חירום וכמובן 3 ימים של אמוקסיצילין. 2. הכנת חיסון המניות הכנה של מניות החיסון צריך להיעשות בסביבה נקיה. את pipettes משמש רק צריך להשתמשד להכנת בידוד. כל הזכוכית וכלי פלסטיק צריכה להיות סטרילי. אנו ממליצים כי מניות חיסון תהיינה מוכנות בחדר ייעודי, באמצעות fumehood מסור וחממה. זני pneumococcal מחוסנים על גבי צלחת אגרה דם. צלחות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס בלילה 2 CO 5%. היום לאחר את כל החיידקים הוא גרד מהצלחת אגרה דם ומחוסן למערכת שימור מניית חרוז. מניות חרוזים אלה משמשים להכנת מלאי חיסון. לבדוק את מלאי חרוזים לזיהום ואחידות מושבה לפני הכנת מלאי חיסון. כדי להכין את מניית החיסון לחסן את צלחת אגרה דם עם שני חרוזים ממניות חרוז סרוטיפ pneumococcal הרצויים, מזנק כדי לכסות את כל הצלחת. דגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס בלילה CO 2 5%. כל incubations הנוסף יהיה להשתמש באותם תנאים אלו. גם דגירת התקשורת במהלך הלילה כדי להבטיח סטריליות Vegitone. הספוגית למחרת בבוקרחצי מהצלחת, נזהר שלא להסיר כל אגר דם, ולהוסיף עד 12 מ"ל של מרק Vegitone מראש מחומם. חזור על שימוש במחצית השנייה של הצלחת. השאר את שני בקבוקונים 12 מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, או עד לשינוי בעכירות מתברר, מוקדם מבין שתיים. הוסף 12 מ"ל עד 40 מ"ל של מרק Vegitone מראש מחומם ומערבב היטב. חזור לבקבוקון 12 מ"ל האחר. זוהי נקודת זמן = 0. הסר 100 μl לקרוא צפיפות האופטית (OD) ב 600 ננומטר. להסיר 20 μl לכימות של חיידקים על ידי יחידת מושבה להרכיב (CFU) ספירה באמצעות וריאציה של השיטה של מיילס ומייסר (M & M) 7. דגירת שני הבקבוקונים. לM & M, לחלק צלחת אגרה דם לשישה חלקים. הוסף 180 μl של סטרילי PBS לשש בארות של צלחת גם 96 (U-תחתון). הוסף 20 μl של המרק לראש היטב ולערבב. סדרתי לדלל את דגימת השש פעמים 1:10 ולהשליך 20 μl מהבאר השישית. 3 10 טיפי μl מקום מן הבאר העליונה לחלקו הראשון שלצלחת אגר דם. חזור לחמש בארות האחרות. להבטיח את הצלחת יבשה לפני זה הוא הפוך ודגר. למחרת לספור את מספר המושבות מוצג בכל סעיף דילול ולהקליט. באמצעות שימוש בסעיף הדילול עם ספירה בין 30 ל 300, מחלק את מספר המושבות גלויות על ידי שלוש כדי להגיע לממוצע. הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולאחר מכן לחלק לפי 10 (כמות הירידה של 10 μl). זה נותן CFU / μl. תכפיל את המספר הזה ב -1000 כדי לקבל CFU / מ"ל. בצע 600 קריאות וכימות של חיידקי OD בשיטת M & M כל שעה עד השלב מוקדם אמצע היומן הוא הגיע, OD של 0.25. ברגע OD זו מגיעה, להוסיף גליצרול לעקר 10% לבקבוקון אחד ולהכין 1 aliquots מ"ל. aliquots בחנויות ב-80 ° C. למנייה מרוכזת יותר, סרכזת הבקבוקון השני ב3345 XG במשך 15 דקות ולהסיר את supernatant. Resuspend גלול ב 22.5 מ"ל של Vegitonבינוני דואר ולהוסיף גליצרול 10%. הכן 1 aliquots וחנויות מ"ל ב -80 ° C. השאר מניות ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 48 שעות לפני ההפשרה וכימות. לכמת את מלאי חיידקים קפוא בשיטת M & M. לבדוק שלושה צינורות מניות בנפרד כדי להבטיח שחזור. השתמש ערך המתקבל כדי לדלל את המניות לריכוז הבידוד הרצוי במלח, כמתואר להלן. לחיסון, כמות pneumococci בבידוד מחושבת לפני ואחרי החיסון. כימות זה של חיידקים על ידי שיטת M & M משמש כדי לקבוע את המספר הממוצע של pneumococci בבידוד המהווה את הזמן שנדרש כדי להשלים את כל ההליך. הכן בידוד, מוהל לריכוז הרצוי, ולבצע כימות בשיטת M & M עבור "חיסון מראש" הספירה. במתקן למחקר הקליני שלנו זה לוקח צוות 30 דקות כדי להשלים את הליך החיסון כולה. Pnמתלי eumococcal במלח ניתן בדרך כלל לראות ספירת ירד בפרק זמן זה. כדי להסביר את זה, אנחנו הנחנו לבידוד המדולל בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ולאחר מכן לבצע "שלאחר חיסון" כימות של החיידקים בשיטת M & M. קח הממוצע של לפני ואחרי כדי לקבוע את הריכוז המחוסן הסופי. התאם את הזמן "יושב" על פי הפרוטוקול הקליני שלך, אבל לשמור על מרווח זמן קצר ככל האפשר. כל המניות החדשות יש לשלוח למעבדת הפניה לאישור של טוהר מניות וזהות. 3. הכנת בידוד הכנת הבידוד צריכה להתחיל 30 דקות לפני מינוי החיסון מתנדב המתוכנן. קח את אחד צינורות המניות שבוצעו בעבר של ° C -80 המקפיא, להפשיר אותה ולסובב את הצינור בmicrocentrifuge על 17,000 XG ל3 דקות. צלחות חמות דם אגר ב37 המעלות צלזיוס החממה. להכיןצלחת 96 גם לכימות חיידקים בשיטת M & M ולהכין צינורות דילול בהתאם למינון הרצוי. הסר את supernatant המרק מצינור centrifuged וresuspend גלול ב 1 מ"ל של תמיסת מלח. צעד זה מסיר את המרק מהבידוד. חזור על שלב צנטריפוגה. הסר את supernatant המלוח וresuspend גלול ב 1 מ"ל של תמיסת מלח. בצע סט לדילול ריכוז בידוד רצוי ולכמת בשיטת M & M. קח את הבידוד למינוי ההתנדבות ולאחר inoculating המתנדבים, חזור כימות במעבדה. תייג את הצינור עם התאריך ומינון בידוד ולאחסן ב -80 ° C. כדי להבטיח עקביות מחיסון לחיסון, חשוב להשתמש באותם pipettes וציוד מעבדה ייעודי בכל פעם. 4. התחסנות מתנדב צריך להיות יושב בנוחות בתנוחה שכיבה למחצה. <li> השימוש P200 פיפטה וטיפי סינון סטריליים לצייר עד 100 μl של הבידוד ולהכניס את הקצה ממש בתוך חלל האף. לאט לגרש את הבידוד על רירית האף בתנועות מעגליות. זה חיוני כי קצה פיפטה אינו בא במגע עם רירית האף כהפרעה בשלמות האפיתל עלול לגרום לחיידקים להיכנס לזרם הדם. הוא גם חיוני כי הבידוד אינו ממוקם רחוק מדי בחזרה או שזה יפעל במורד הגרון, זה צריך לשכון בתוך חלל האף. חזור לnaris האחר. יש מתנדבים להישאר בעמדה שכיבה למחצה עבור 10 דקות ללא מרחרח או נושב האף. זה מאפשר זמן לחיידקים להתפזר על פני הרירית. 5. ניטור מתנדבים נמצאים במעקב יומי לאחר חיסון. זה כולל הודעת טקסט יומית נשלחה על ידי מתנדב לחוקרים לפני 2 בצהריים. אם טקסטילא קבל ב 2 הצהרים מתנדבים יהיה קשר כדי להבטיח / הרגשתו הטובה. אם הוא / היא לא מגיב, שאר הבשר הבא יוקצו יהיה קשר כדי להבטיח הרווחה של המתנדב. מתנדב מתבקשים לדווח על כל תסמינים בדרכי נשימה עליונים בכל פגישה. צוות קליני יבקש מתנדב לתיאור הסימפטומים שלו / שלה ויודיע לי שום תלונה. את האנטיביוטיקה שניתנה למתנדבים הן רק לתילקח בשלוש נסיבות: במקרה שהם אינכם חשים בטוב וקבלו הנחיות לקחת אותם על ידי צוות המחקר, אם הם נושאים pneumococcus בסוף המחקר, או אם הם אינכם חשים בטוב והצליח ליצור קשר עם צוות המחקר. מתנדב מתבקש לשמור על חבילת חירום זה איתם בכל העת במהלך המחקר ומתבקש ליצור קשר עם צוות המחקר על בסיס יומי במשך 7 הימים הבאים. צוות שלנו זמין 24/7 באמצעות מגע אחות במהלך שעתי עבודה ושני רופאים זמינים מתוך הואורס. כל שאילתות מטופלות על ידי שיחת טלפון ו / או ביקורת מיידית. הוראות זמינות להודאה מיידית וישירה למחלקת מחל מדבקות, במידת צורך. 6. אף Wash (NW) נוהל שטיפות אף (NW) מתבצעות בביקור ראשוני הקרנה, כמו גם 48 שעות, 7 ו 14 ימים לאחר החיסון. שיטת NW משמשת נלקחת מNaclerio et al. 8 מתנדב באופן טבעי מאוכלס על ידי ס דלקת ריאות אינן נכלל בחיסון והמעקב. מתנדב יושב בנוחות ובראשו מוטה לאחור 30 מעלות מהאנך. שאל מתנדב לקחת נשימה עמוקה ובלעצור את נשימתם בזמן דוחף את הלשון שלהם למעלה ואחורה על הגג של הפה. בעוד בעמדה זו, המתנדב בקש לאותת שהם מוכנים. מזרק מלא בתמיסת מלח 20 מ"ל מוכנס לתוך חלל האף הקדמי ו5 מ"ל של תמיסת מלח הוא גורש. Volunteer ורוכן באופן מיידי והרחקת הנוזל על ידי נשיפה דרך אפם במהירות לתוך קערת נייר כסף. חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות, כך שכל naris כבר שטף פעמים ו20 מ"ל המלא כבר בשימוש. ברכה לכל הדוגמות יחד בצינור צנטריפוגה ולשלוח למעבדה בטמפרטורת חדר לעיבוד. 7. אף שטפי עיבוד צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות ב3345 x גרם. הסר את supernatant וחנות כ1 aliquots מ"ל בשפופרות Eppendorf שכותרת ב-80 ° C. הוסף 100 μl של STGG בינוני 9 לגלולה ומערבבת היטב. ודא שעוצמת הקול הכוללת בצינור בשלב זה נקבעה. דילול זה ישמש בחישוב CFU של עגלת NW החיובי. צלחת טיפת μl 20 מתוך STGG מכיל גלולת resuspended על גבי צלחת אגרה דם המכילה גנטמיצין ופס כל הצלחת. אם NW הוא שלאחר החיסון, להסיר 10 μl מSTGG מכיל גלולה ושימוש לכימות חיידקים בשיטת M & M resuspended. הוסף 800 μl נוסף של STGG לצינור NW ומערבב היטב. 25 μl צלחת על גבי צלחת אגר דם ו25 μl על גבי צלחת אגרה שוקולד, נמרח כל הצלחת. לחלק את חיידקי הסכום הנותרים המרחפים בSTGG בינוני לתוך 2 cryovials וחנויות ב-80 ° C. דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בלילה ב5% CO 2. לבחון את הצלחות למחרת לpneumococcus ומזיקים פוטנציאליים אחרים בדרכי נשימה. Pneumococci מזוהים על ידי צלחות מורפולוגיה מושבה. מושבות haemolytic אלפא עם מורפולוגיה שרטט הן תת תרבותיות על אגר דם עם דיסק optochin וטופחו במשך הלילה. מושבות pneumococcal משוערות שoptochin רגישים מוכתמות גראם לאשר diplococci גראם החיובי וserotyped באמצעות Statens סרום מכון Pneuערכת motest-אטקס.