Experimentelle Menschliche Pneumokokken Carriage

Ein. Ehrenamtliche Auswahl und Screening Gesunde Probanden durch Plakatwerbung und auf der Website der Universität nach dem NHS Forschung und Ethik Ausschuss Führung rekrutiert. Die Einschlusskriterien für die Teilnahme sind: Erwachsene im Alter von 18-60 Jahren. Spricht fließend Englisch und ist in der Lage, einfach zu kommunizieren sowohl Mobiltelefon und SMS. Die Ausschlusskriterien für die Teilnahme sind: Enger Kontakt mit gefährdeten Personen (Kinder, immunsupprimierten Erwachsenen, älteren, chronisch krank). Aktuelle Raucher oder bedeutende Geschichte das Rauchen (> 10 pack Jahre). Asthma oder anderen Atemwegserkrankungen. Schwangerschaft. Allergie gegen Penicillin oder Amoxicillin. Aktuelle Beteiligung an einer anderen klinischen Studie sei denn, Beobachtung oder in nicht-interventionellen Phase. Nicht vollständig informierte Einwilligung zu geben. Eine erste Screening-Visite, etwa eine Woche vor der Impfung, eine fokussierte Anamnese und gezielte klinische Untersuchung. Wenn eine zuvor unerkannte Störung gefunden wird, wird der Freiwillige aus der Studie ausgeschlossen und entsprechende Untersuchung wird durch die Grundversorgung organisiert werden. Während des anfänglichen Screening über eine Blutbild erhalten wird, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Leukozyten im Normalbereich ist vor der Inokulation Besuch. Eine Nasenspülung wird durchgeführt, um natürliche Pneumokokken Träger auszuschließen (vgl. 6,1). Vor der Inokulation werden Freiwillige auf den Risiken, die mit der Teilnahme an der Studie beteiligten erzogen und sind mit einem Notfall Packungsbeilage, digitale Thermometer, Notrufnummern und 3-Tages-Kurs von Amoxicillin vorgesehen. 2. Vorbereitung der Impfung Stocks Vorbereitung der Impfung Bestände müssen in einer sauberen Umgebung durchgeführt werden. Die Pipetten verwendet werden, sollten nur verwendet werdend für Inokulumzubereitung. Alle Glas-und Kunststoff-ware sollten steril sein. Wir empfehlen, dass Impfen Aktien in einem eigenen Raum vorbereitet werden, mit einem dedizierten fumehood und Inkubator. Pneumokokken-Stämme werden auf einer Agarplatte beimpft. Die Platten werden bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht inkubiert. Die folgenden Tage alle Bakterien aus dem Blut-Agar-Platte abgeschabt und geimpft zu einem Wulst Bestandserhaltung System. Diese Raupe Aktien werden für die Impfung Stoffaufbereitung. Testen Sie die Perlen Aktien für Verschmutzung und Kolonie Einheitlichkeit vor der Zubereitung eine Impfung Lager. Um die Inokulation Lager herzustellen, anzuimpfen eine Agarplatte mit zwei Wülsten von der gewünschten Pneumokokken Serotyp Wulst Lager, Ausstreichen, um die gesamte Platte abzudecken. Inkubieren Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht. Alle weiteren Inkubationen verwenden diese gleichen Bedingungen. Auch bebrüten die Vegitone media Nacht, um die Sterilität zu gewährleisten. Am nächsten Morgen TupferHälfte der Platte, dabei nicht zu entfernen Blutagar, und fügen Sie 12 ml vorgewärmtes Vegitone Brühe. Wiederholen Sie mit der anderen Hälfte der Platte. Lassen Sie die zwei 12 ml-Fläschchen bei 37 ° C für 2 Stunden oder bis eine Veränderung der Trübung wird deutlich, was zuerst eintritt. Fügen Sie die 12 ml bis 40 ml vorgewärmtes Vegitone Brühe und mischen. Wiederholen Sie dies für die anderen 12 ml Fläschchen. Dies ist Zeitpunkt = 0 ist. 100 ul zu entfernen, um die optische Dichte (OD) bei 600 nm abgelesen. Entfernen 20 ul zur Quantifizierung der Bakterien durch koloniebildende Einheit (CFU) Zählung unter Verwendung einer Variation des Verfahrens von Miles und Misra (M & M) 7. Inkubieren beide Fläschchen. Für die M & M, teilen eine Agarplatte in sechs Abschnitte. Fügen Sie 180 ul sterilem PBS zu sechs Vertiefungen einer 96-Well-Platte (U-Boden). Fügen Sie 20 ul der Brühe nach oben gut und mischen. Serienmäßig wird die Probe 1.10 sechsmal und entsorgen 20 ul aus dem sechsten gut. Platz drei 10 ul Tropfen von oben auch in den ersten Abschnitt desBlutagarplatte. Wiederholen Sie dies für die fünf anderen Brunnen. Sicherstellen, dass die Platte trocken ist, bevor es invertiert und inkubiert. Am nächsten Tag die Anzahl der sichtbaren Kolonien in jeder Verdünnung Abschnitt und aufzeichnen. Verwendung der Verdünnung Abschnitt mit einer Anzahl zwischen 30 und 300, unterteilen die Anzahl der sichtbaren Kolonien durch drei um einen Durchschnittswert zu bekommen. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dann geteilt durch 10 (die Menge der 10 ul drop). Dies gibt CFU / ul. Multiplizieren Sie diese Zahl um 1.000 auf CFU / ml erhalten. Führen OD 600 Lesungen und Quantifizierung der Bakterien durch M & M Verfahren stündlich bis frühen mittleren log-Phase erreicht wird, einen Außendurchmesser von 0,25. Sobald dies OD erreicht, so ist sterilisiert 10% Glycerin zu einem Fläschchen und Herstellung von 1 ml Aliquots. Shop Aliquots bei -80 ° C. Für eine konzentrierte Lager, zentrifugieren Sie das andere Gefäß bei 3.345 xg für 15 min und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 22,5 ml Vegitone mittleren und 10% Glycerin. Bereiten Sie 1 ml und bei -80 ° C. Lassen Aktien bei -80 ° C für mindestens 48 Stunden vor dem Auftauen und Quantifizierung. Quantifizierung des gefrorenen Bakterien Aktie durch den M & M-Methode. Testen Sie drei Lager Röhren einzeln um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Verwenden Sie den Wert erhalten, den Bestand an die gewünschte Inokulumkonzentration in Kochsalzlösung verdünnen, wie unten beschrieben. Für eine Inokulation wird die Menge von Pneumokokken in dem Inokulum vor und nach der Inokulation berechnet. Diese Quantifizierung der Bakterien durch die M & M Verfahren wird verwendet, um die durchschnittliche Anzahl von Pneumokokken in dem Inokulum, das für die Zeit, die es braucht, um die gesamte Verfahren ausführen ausmacht bestimmen. Bereiten Sie ein Inokulum, Verdünnen auf die gewünschte Konzentration, und führen Sie die Quantifizierung durch die M & M-Methode für die "pre-Impfung" zählen. In unserem Clinical Research Facility dauert es dem Team 30 min, um die gesamte Impfung abzuschließen. Pneumococcal Suspensionen in Kochsalzlösung wird in der Regel zeigen eine verringerte Anzahl in diesem Intervall. Um dies zu berücksichtigen, lassen wir die verdünnte Inokulum sitzen bei Raumtemperatur für 30 min und dann eine "post-Impfung" Quantifizierung der Bakterien durch die M & M-Methode. Der Mittelwert der vor und nach den endgültigen inokuliert Konzentration zu bestimmen. Stellen Sie die "sitzend" Zeit nach Ihrer klinischen Protokoll, sondern halten das Intervall so kurz wie möglich. Alle neuen Aktien sollten an ein Referenzlabor zur Bestätigung auf Lager Reinheit und Identität gesendet werden. 3. Inokulumzubereitung Vorbereitung des Inokulums sollte 30 Minuten vor der geplanten freiwilligen Impfung Termin beginnen. Nehmen Sie eine der bisherigen Lager Rohre aus dem -80 ° C Gefrierschrank, auftauen und drehen Sie das Rohr in der Mikrozentrifuge bei 17.000 xg für 3 min. Warm Blutagarplatten in der 37 ° C-Inkubator. Vorbereiteneine 96-Well-Platte für die bakterielle Quantifizierung von M & M Verfahren und bereiten Verdünnungsröhrchen entsprechend der gewünschten Dosis. Entfernen der Brühe aus dem zentrifugierten Überstand Rohr und das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung. Dieser Schritt entfernt die Brühe aus dem Inokulum. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Entfernen Sie die Kochsalzlösung Überstand und das Pellet in 1 ml Kochsalzlösung. Führen Verdünnung Satz für die gewünschte Inokulumkonzentration und Quantifizierung von M & M-Methode. Nehmen Sie das Inokulum der Freiwilligen Ernennung und nach Beimpfen die Freiwilligen, wiederholen Sie die Quantifizierung im Labor. Das Röhrchen mit dem Datum und Inokulum Dosis und bei -80 ° C. Um die Konsistenz Inokulation bis Inokulation zu gewährleisten, ist es wichtig, die gleichen Pipetten und engagierten Laborgeräte jedes Mal verwenden. 4. Impfung Freiwillige sollten bequem in einem halb liegende Position sitzen. <li> Mit einem P200 Pipette und Sterilfilter Tipps auszuarbeiten 100 ul des Inokulums und die Spitze nur innerhalb der Nasenhöhle. Langsam vertreiben das Inokulum auf die Nasenschleimhaut mit einer kreisförmigen Bewegung. Entscheidend ist, dass die Pipettenspitze nicht in Kontakt mit der Nasenschleimhaut kommen als Störung der Integrität des Epithels könnte in den Bakterien in die Blutbahn führt. Es ist auch wichtig, dass das Inokulum nicht zu weit nach hinten oder platziert wird es laufen in den Rachen, es sollte in der Nasenhöhle befinden. Wiederholen Sie dies für die anderen Nasenloch. Haben die Freiwilligen in der halb liegende Position bleiben für 10 min ohne Sniffing oder Schneuzen. Diese Zeit ist notwendig, um die Bakterien durch die Schleimhaut zu dispergieren. 5. Überwachung Volunteers werden täglich nach der Impfung überwacht. Dies beinhaltet eine tägliche SMS von den Freiwilligen die Ermittler vor 02.00 Uhr gesendet. Wenn der Text is nicht empfangen um 2 Uhr die Freiwillige kontaktiert wird sein / ihr Wohlbefinden zu gewährleisten. Wenn er / sie nicht reagiert, wird die zugeordnete nächsten Angehörigen kontaktiert, um der Freiwilligen Wohlbefinden zu gewährleisten. Freiwillige werden gebeten, auf allen oberen Atemwege Symptome bei jedem Termin berichten. Klinikpersonal fragt die Freiwillige seine / ihre Symptome zu beschreiben und Follow-up keine Beschwerden. Die Antibiotika gegeben, um den Freiwilligen sind nur unter drei Umstände berücksichtigt werden, in dem Fall, dass sie krank sind und werden angewiesen, die ihnen von dem Forschungsteam zu nehmen, wenn sie die Durchführung Pneumokokken sind am Ende der Studie, oder wenn sie sich unwohl und unfähig, die Forschungs-Team zu kontaktieren. Der Freiwillige wird ermutigt, diese Notlicht mit ihnen halten zu allen Zeiten während der Studie und wird gebeten, das Forschungsteam auf einer täglichen Basis für die nächsten 7 Tagen kontaktieren. Unser Team ist 24/7 erreichbar mit Krankenschwester Kontakt während der Arbeitszeit und zwei Ärzte zur Verfügung von hours. Alle Anfragen werden mit per Telefonanruf und / oder sofortige Überprüfung behandelt. Rückstellungen für unmittelbare, direkte Zulassung zu einer Infectious Disease Abteilung zur Verfügung, wenn nötig. 6. Nasal Wash (NW) Procedure Nasal Waschen (NW) in einem ersten Screening-Visite, sowie 48 Stunden, 7 und 14 Tage nach der Inokulation durchgeführt. Die NW-Methode verwendet wird, aus Naclerio et al. 8 Freiwillige natürlich kolonisiert durch S. pneumoniae sind Inokulation ausgeschlossen und Follow-up. Der Freiwillige ist komfortabel und sitzt der Kopf wird wieder 30 ° aus der Senkrechten geneigt. Bitten Sie die Freiwilligen einen tiefen Atemzug zu nehmen und halten den Atem an, während schob ihre Zunge nach oben und hinten gegen das Dach des Mundes. Während in dieser Stellung wird der Proband gebeten zu signalisieren, dass sie bereit sind. Eine Spritze mit 20 ml Kochsalzlösung gefüllt ist in die vordere Nase Raum eingeführt und 5 ml Kochsalzlösung ausgestoßen wird. Die volunteer dann nach vorne beugt sofort und vertreibt die Flüssigkeit durch Ausatmen schnell durch die Nase in eine Folie Schüssel. Diesen Vorgang 3 mal so daß jedes Nasenloch wurde zweimal gewaschen und die vollen 20 ml verwendet wurde. Pool alle Proben zusammen in einem Zentrifugenröhrchen und senden an das Labor bei Raumtemperatur für die Verarbeitung. 7. Nasal Wash Verarbeitung Zentrifugation der Proben für 10 min bei 3345 x g. Entfernen Sie den Überstand und Speicher als 1 ml Aliquots in beschrifteten Eppendorf-Röhrchen bei -80 ° C. Fügen Sie 100 ul StGG Medium 9 zu dem Pellet und gründlich mischen. Sicherstellen, dass das Gesamtvolumen im Rohr an dieser Stelle bestimmt wird. Diese Verdünnung wird bei der Berechnung der CFU eines Wagens positive NW verwendet werden. Platte eine 20 ul Tropfen des StGG mit dem resuspendierten Pellets auf einer Agarplatte mit Gentamicin und streifenfrei die gesamte Platte. Wenn die NW ist nach der ImpfungEntfernen Sie 10 ul aus dem StGG mit dem resuspendierten Pellets und Einsatz für bakterielle Quantifizierung durch M & M-Methode. Hinzufügen 800 ul StGG der NW Rohr und gründlich mischen. Platte 25 ul auf eine Agarplatte und 25 ul auf eine Schokolade Agarplatte, Schlieren die gesamte Platte. Teilen Sie die verbleibenden Bakterien in StGG Medium in 2 Kryoröhrchen und bei -80 ° C suspendiert Die Inkubation bei 37 ° C über Nacht in 5% CO 2. Die Platten am nächsten Tag für Pneumokokken und andere potenzielle Atemwegspathogene. Pneumokokken sind auf Platten durch Kolonie Morphologie identifiziert. Alpha hämolytische Kolonien mit Zeichner Morphologie subkultiviert auf Blut-Agar mit einem Optochin Disc und über Nacht inkubiert. Mutmaßlich Pneumokokken Kolonien, Optochin sensitive sind, Gram gefärbt, um Gram positive Diplokokken bestätigen und serotypisiert mit dem Statens Serum Institut Pneumotest-Latex-Kit.