Experimentele Human Pneumokokken vervoer

1. Vrijwilliger selectie en screening Gezonde vrijwilligers worden geworven via poster advertenties en op de website van de Universiteit op basis van de NHS Research and Ethics Committee begeleiding. De inclusiecriteria voor deelname zijn: Volwassenen van 18-60 jaar. Spreekt vloeiend Engels en is in staat om gemakkelijk te communiceren met zowel mobiele telefoon en sms. De uitsluitingscriteria voor deelname zijn: Nauw contact met het risico individuen (kinderen, immunosuppressie volwassenen, ouderen, chronisch slechte gezondheid). Huidige roker of belangrijke rokers geschiedenis (> 10 pack jaar). Astma of andere luchtwegaandoeningen. Zwangerschap. Allergie voor penicilline of amoxicilline. Huidige betrokkenheid bij een ander klinisch onderzoek, tenzij waarnemingen of aan niet-interventionele fase. Kan volledig geïnformeerde toestemming te geven. Een eerste screening bezoek, ongeveer een week voor enting, bestaat uit een gerichte anamnese en gericht klinisch onderzoek. Als een eerder opgenomen afwijking wordt gevonden, zal de vrijwilliger worden uitgesloten van de studie en de nodige onderzoeken zal worden geregeld via de eerste lijn. Tijdens de eerste screening een bezoek aan een volledig bloedbeeld wordt verkregen om ervoor te zorgen dat het aantal witte bloedcellen is binnen het normale bereik voor de inoculatie bezoek. Een nasale wassen wordt uitgevoerd om natuurlijke pneumokokken dragers uitgesloten (zie 6.1). Voorafgaand aan inoculatie, worden vrijwilligers opgeleid op de risico's van deelname aan het onderzoek en zijn voorzien van een noodsituatie bijsluiter, digitale thermometer, noodnummers en 3 daagse cursus van amoxicilline. 2. Voorbereiding van Inoculatie Voorraden Bereiding van de inoculatie voorraden worden uitgevoerd in een schone omgeving. De gebruikte pipetten dienen enkel gebruikt wordend inoculum voor bereiding. Alle glas en plastic waren moet steriel zijn. Wij raden inoculatie voorraden worden bereid in een speciale ruimte, met behulp van een speciale fumehood en incubator. Pneumokokken stammen worden geënt op een bloed agar plaat. Platen worden geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de nacht. De volgende dag zijn alle bacteriën wordt geschraapt uit het bloed agar plaat en geënt in een kraal voorraad archiveringssysteem. Deze kraal voorraden worden gebruikt voor inoculatie voorraad voorbereiding. Test de kraal voorraden op vervuiling en kolonie uniformiteit voor de voorbereiding van een inenting voorraad. Om de inoculatie voorraad te bereiden, enten een bloed agar plaat met twee kralen van de gewenste pneumokokken serotype kraal voorraad, strepen om de hele plaat te dekken. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de nacht. Alle verdere incubaties gebruikt gelijke condities. Ook broeden de Vegitone afdrukmateriaal 's nachts om steriliteit te waarborgen. De volgende ochtend wattenstaafjede helft van de plaat, zorg ervoor dat u geen bloed agar te verwijderen en toe te voegen aan 12 ml voorverwarmde Vegitone bouillon. Herhaal met de andere helft van de plaat. Laat de twee 12 ml flesjes bij 37 ° C gedurende 2 uur of totdat een verandering in troebelheid optreedt, wat het eerst komt. Voeg de 12 ml tot 40 ml voorverwarmde Vegitone bouillon en meng. Herhaal dit voor de andere 12 ml flacon. Dit is tijdstip = 0. Verwijder 100 ul met de optische dichtheid (OD) bij 600 nm gelezen. Verwijder 20 ul voor het kwantificeren van bacteriën door kolonievormende eenheid (CFU) count met een variant van de werkwijze van Miles en Misra (M & M) 7. Incubeer beide flacons. Voor de M & M, verdeel een bloed agar plaat in zes delen. Voeg 180 ul steriel PBS zes putjes van een plaat met 96 putjes (U-bodem). Voeg 20 ul van de bouillon boven goed en meng. Serieel verdunnen van het monster 1:10 zes keer en gooi 20 ul van de zesde goed. Plaats drie druppels van 10 ul boven ver in het eerste deel van debloed agarplaat. Herhaal dit voor de vijf andere bronnen. Zorg ervoor dat de plaat droog is voordat het wordt omgekeerd en geïncubeerd. De volgende dag telt het aantal zichtbare kolonies in elke verdunning sectie en record. Met de verdunning gedeelte met een aantal tussen 30 en 300, delen het aantal zichtbare kolonies door drie van een gemiddelde. Vermenigvuldig het gemiddelde aantal kolonies met de verdunningsfactor en delen door 10 (het bedrag van de druppel 10 pi). Dit geeft CFU / ul. Vermenigvuldig dit getal met 1.000 tot CFU / ml te krijgen. Voer OD600 metingen en kwantificering van bacteriën door M & M werkwijze per uur tot begin mid-log fase wordt bereikt, een OD van 0,25. Zodra deze OD bereikt, voeg gesteriliseerde 10% glycerol aan een flesje en bereiden 1 ml aliquots. Store aliquots bij -80 ° C. Voor een meer geconcentreerde voorraadoplossing wordt gecentrifugeerd andere flacon 3345 xg gedurende 15 min en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de pellet in 22,5 ml van Vegitone middellange en voeg 10% glycerol. Bereid 1 ml aliquots en bij -80 ° C. Reactie voorraad bij -80 ° C gedurende ten minste 48 uur voor ontdooien en kwantificeren. Kwantificeer de bevroren bacteriële voorraad door de M & M-methode. Individueel te testen drie stock buizen om reproduceerbaarheid te garanderen. Gebruik de gemeten waarde van de voorraad te verdunnen tot de gewenste concentratie inoculum in zoutoplossing, zoals hieronder beschreven. Voor inoculatie wordt de hoeveelheid in de pneumococcen inoculum berekend voor en na de inoculatie. Kwantificering van bacteriën door de M & M methode wordt gebruikt om het gemiddelde aantal pneumococcen in het inoculum die goed is voor de tijd die nodig is om de gehele procedure te bepalen. Bereid een inoculum, verdunnen tot de gewenste concentratie en voer kwantificering van de M & M werkwijze voor de "pre-inoculatie" count. In onze Clinical Research Facility duurt het team 30 min in beslag de hele inoculatie procedure. Pneumococcal schorsingen in een zoutoplossing zal geven over het algemeen een verminderde tellen in dit interval. Om rekening te houden voor deze, laten we de verdunde inoculum zitten bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en vervolgens een "post-inoculatie" kwantificering van de bacteriën door de M & M-methode. Het gemiddelde van de voor en na de definitieve geïnoculeerd concentratie te bepalen. Pas de "zitten" tijd op basis van uw klinisch protocol maar houd het interval zo kort mogelijk. Alle nieuwe aandelen dienen te worden verzonden naar een referentielaboratorium voor de bevestiging van voorraad zuiverheid en identiteit. 3. Inoculumbereiding Bereiding van het entmateriaal moet beginnen 30 minuten vóór de geplande vrijwilliger inoculatie afspraak. Neem een ​​van de eerder gemaakte voorraad buizen uit de -80 ° C vriezer, ontdooi het en draai de buis in de microcentrifuge bij 17.000 xg gedurende 3 minuten. Warm bloedagarplaten in de 37 ° C incubator. Bereideneen 96 wells plaat bacteriële kwantificering van M & M werkwijze en bereiden verdunning buizen volgens de gewenste dosis. Verwijder het supernatant van de bouillon gecentrifugeerd buis en resuspendeer de pellet in 1 ml zoutoplossing. Deze stap verwijdert de bouillon van de inoculum. Centrifugeer nogmaals stap. Verwijder het supernatant zoutoplossing Resuspendeer de pellet in 1 ml zoutoplossing. Voer verdunning set voor de gewenste inoculum concentratie en kwantificeren door M & M-methode. Neem het inoculum aan de vrijwilliger benoeming en na inoculatie van de vrijwilligers, de kwantificering te herhalen in het lab. Label de buis met de datum en inoculum dosis en bij -80 ° C. Om consistentie van inoculatie tot inoculatie, is het belangrijk om dezelfde pipetten en toegewijde laboratoriumapparatuur telkens. 4. Inenting Vrijwilligers moeten comfortabel zitten in een semi-liggende positie. <li> Met behulp van een P200 pipet en steriele filter tips opstellen 100 ul van het inoculum en steek de punt net binnen de neusholte. Langzaam verdrijven het inoculum op het neusslijmvlies met een draaiende beweging. Het is essentieel dat de pipetpunt niet in aanraking komt met de nasale mucosa als een verstoring in de integriteit van het epitheel kan leiden tot de bacteriën in de bloedbaan. Het is ook van vitaal belang dat het inoculum niet te ver naar achteren geplaatst of het zal lopen in de keel, maar moet wonen in de neusholte. Herhaal dit voor de andere Naris. Laat de vrijwilliger in de semi-liggende positie te blijven gedurende 10 minuten zonder snuiven of snuiten van de neus. Dit maakt tijd voor de bacteriën om zich te verspreiden over de mucosa. 5. Monitoring Vrijwilligers worden dagelijks gecontroleerd na inoculatie. Dit is inclusief een dagelijks tekstbericht verzonden door de vrijwilliger aan onderzoekers voor 2 uur. Als de tekst is niet ontvangen door 2 uur de vrijwilliger gecontacteerd zijn / haar welzijn waarborgen. Als hij / zij niet reageert, zal de toegewezen nabestaanden contact worden opgenomen om de vrijwilliger het welzijn te garanderen. Vrijwilligers wordt gevraagd te rapporteren over alle bovenste luchtwegen symptomen bij elke afspraak. Klinische personeel zal u vragen de vrijwilliger zijn / haar symptomen te beschrijven en zal follow-up geen klachten. De antibiotica die aan de vrijwilligers alleen worden genomen onder drie omstandigheden, indien ze onwel en geïnstrueerd om ze door het onderzoeksteam, indien zij die pneumococcus aan het einde van de studie, of als ze onwel en niet in staat om het onderzoeksteam te contacteren. De vrijwilliger wordt aangemoedigd om deze noodsituatie pak houden met hen te allen tijde tijdens de studie en wordt verzocht om het onderzoeksteam contact op een dagelijkse basis voor de komende 7 dagen. Ons team is 24/7 bereikbaar met verpleegster contact tijdens de werkuren en twee artsen beschikbaar op hours. Alle vragen worden behandeld door telefoongesprek en / of onmiddellijke herziening. Voorzieningen zijn beschikbaar voor onmiddellijke, directe toegang tot een infectieziekte afdeling, indien nodig. 6. Nasale Wash (NW) Procedure Nasale wasvloeistoffen (NW) worden uitgevoerd bij een eerste screening bezoek en 48 uur, 7 en 14 dagen na de inoculatie. De gebruikte NW methode is ontleend Naclerio et al.. 8 vrijwilligers natuurlijk gekoloniseerd door S. pneumoniae zijn uitgesloten van inoculatie en follow-up. De vrijwilliger is comfortabel zitten en het hoofd wordt weer gekanteld 30 ° van de verticale. Vraag de vrijwilliger om diep adem in te nemen en hun adem in te houden terwijl duwen hun tong op en naar achteren tegen het dak van de mond. Hoewel in deze positie wordt de vrijwilliger gevraagd om aan te geven dat ze klaar zijn. Een spuit met 20 ml zoutoplossing wordt in het voorste nasale ruimte en 5 ml zoutoplossing wordt uitgedreven. De volunteer leunt dan naar voren onmiddellijk en verdrijft het vocht door uitademen snel door hun neus in een folie kom. Herhaal deze procedure 3 keer zodat iedere Naris is tweemaal gewassen en de volledige 20 ml werd gebruikt. Pool alle monsters samen in een centrifugebuis en naar het laboratorium bij kamertemperatuur verwerking. 7. Nasale wassen Processing Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 3345 x g. Verwijder het supernatant en opslaat als 1 ml porties in gelabelde Eppendorf buisjes bij -80 ° C. Voeg 100 ul van STGG medium 9 tot en met de pellet en meng goed. Toe dat de totale volume in de buis op dit punt wordt bepaald. Deze verdunning wordt de berekening van de CFU van een rijtuig positieve NW. Plaat een 20 ul druppel van de STGG met de geresuspendeerde pellet op een agar plaat met gentamicine en streeploos de hele plaat. Als de NW is na inoculatieVerwijder 10 pi van de STGG met de geresuspendeerde pellet en het gebruik van bacteriële kwantificering van M & M methode. Voeg een 800 ul van STGG-NW buis en meng goed. Plaat 25 pi op een agar plaat en 25 pi op een chocolade agar plaat, strepen de hele plaat. Verdeel het resterende bedrag bacteriën gesuspendeerd in STGG medium in 2 cryovials en bewaar bij -80 ° C. Incubeer de platen bij 37 ° C geïncubeerd in 5% CO2. Onderzoek de platen de volgende dag voor pneumokokken en andere potentiële respiratoire pathogenen. Pneumokokken worden geïdentificeerd op platen door kolonie morfologie. Alpha hemolytische kolonies met tekenaar morfologie zijn sub-gekweekte op bloed-agar met een optochin schijf en 's nachts geïncubeerd. Vermoedelijke pneumokokken kolonies die optochin gevoelig zijn Gram gekleurd door Gram positieve diplokokken bevestigen en geserotypeerd met behulp van het Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.