Экспериментальные человека перевозке пневмококковой

1. Волонтер Выбор и скрининг Здоровые добровольцы набираются через сайт рекламы и на веб-сайте университета в соответствии с NHS исследований и Комитет по этике руководства. Критерии включения для участия являются: Взрослые в возрасте 18-60 лет. Свободно владеет английским языком и имеет возможность общаться легко, как мобильные телефоны и текстовые сообщения. Критериями исключения для участия являются: Тесный контакт с лицами риска (дети, взрослые ослабленным иммунитетом, пожилые, хронические заболевания). Курение курильщик или значительное истории (> 10 шт лет). Астма и другие заболевания дыхательных путей. Беременность. Аллергия на пенициллин или амоксициллин. Данной участие в другом клиническом испытании, если наблюдений или в не-интервенционных фазу. Не в состоянии дать осознанное согласие. Первого визита скрининга, примерно за неделю до прививки, включает в себя целенаправленное истории болезни и целенаправленное клиническое обследование. Если ранее неизвестные аномалии найдено, добровольцев будут исключены из исследования, и соответствующие расследования будут согласованы по первичной медицинской помощи. В ходе первоначального скрининга посетить полный анализ крови получают для того, чтобы количество лейкоцитов находится в пределах нормального диапазона перед прививкой визитом. Стирка носовых проводится, чтобы исключить естественными носителями пневмококка (см. п. 6.1). Перед прививкой, волонтеры обучаются на риски, связанные с участием в исследовании и снабжены листовки чрезвычайных пациента, цифровой термометр, номера экстренных телефонов и 3-дневный курс амоксициллина. 2. Подготовка Прививка Акции Подготовка прививки акций должно быть сделано в чистой окружающей среде. Пипетки использовать следует только использоватьD для подготовки посевного материала. Все стеклянные и пластмассовые изделия должны быть стерильными. Мы рекомендуем прививки запасы быть подготовлены в специальной комнате, используя специальный fumehood и инкубатор. Пневмококковых штаммов засевают на кровяной агар пластины. Планшеты инкубировали при 37 ° С в 5% СО 2 в течение ночи. На следующий день все бактерии соскабливают с пластинки агара крови и засевают в бисер система сохранения запасов. Эти борта запасы используются для прививки подготовки массы. Проверьте борт запасы на предмет загрязнения и колонии единообразия перед приготовлением прививки акций. Для получения прививки акции, привить пластины кровяной агар с двумя бусы из желаемого пневмококковых серотипов складе шарик, полос, чтобы покрыть всю тарелку. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° С в 5% СО 2 в течение ночи. Все последующие инкубации будет использовать эти же условия. Также инкубировать Vegitone СМИ ночь, чтобы обеспечить стерильность. Следующим утром тампонполовина пластины, заботясь, чтобы не удалить кровяной агар, и добавьте в 12 мл подогретого Vegitone бульон. Повторите с помощью других половину тарелки. Оставьте два 12 мл флаконах при 37 ° C в течение 2 часов или до изменения мутности становится очевидным, что наступит раньше. Добавить 12 мл до 40 мл подогретого Vegitone бульон и тщательно перемешайте. Повторите для другой 12 мл флакон. Это момент времени = 0. Удалить 100 мкл читать оптической плотности (ОП) при 600 нм. Удалить 20 мкл для количественного определения бактерий, образующих колонии единицы (КОЕ) подсчет с помощью изменения метода Майлз и Мишра (M & M) 7. Инкубируйте и флаконах. Для M & M, разделить тарелку кровяной агар из шести разделов. Добавить 180 мкл стерильной PBS до шести скважин 96-луночный планшет (U-вниз). Добавить 20 мкл бульона и сверху и перемешать. Серийно разбавить образец 1:10 в шесть раз и выбросить 20 мкл с шестого хорошо. Место три 10 мкл капли сверху хорошо в первом разделепластину кровяной агар. Повторите эти действия для остальных пяти скважин. Убедитесь, что пластина сухой перед его переворачивают и инкубируют. На следующий день подсчитать число видимых колоний в каждой секции разведения и записи. С помощью разбавления раздел с числом от 30 до 300, делят число видимых колоний на три, чтобы получить среднее. Умножьте среднее число колоний на коэффициент разбавления, а затем разделить на 10 (количество 10 мкл капли). Это дает КОЕ / мкл. Умножьте это число на 1000, чтобы получить КОЕ / мл. Выполните OD 600 показаний и количественного бактерий, M & M метода каждый час до начала середине логарифмической фазы будет достигнута, ОР 0,25. Как только это будет достигнуто OD, добавить стерилизованные 10% глицерина в одном флаконе и приготовления 1 порции мл. Магазин аликвоты при -80 ° C. Для более концентрированных акции, центрифуги другой флакон в 3345 мкг в течение 15 минут и удалить супернатант. Ресуспендируют гранул в 22,5 мл Vegitonсредний е и добавить 10% глицерина. Подготовить 1 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C. Оставьте запасов при -80 ° C в течение по крайней мере 48 часа до оттаивания и количественной оценки. Количественная замороженных бактериальных акции по M & M методом. Тестирование трех труб складе индивидуально для обеспечения воспроизводимости. Используйте полученное значение для разбавления складе в нужное посевной концентрации в растворе, как описано ниже. Для прививки, количества пневмококков в посевной рассчитана до и после прививки. Это количественная бактерий, M & M метод используется для определения среднего количества пневмококков в посевной на долю которых приходится на время, необходимое для завершения всей процедуры. Подготовка посевного материала, разбавление до нужной концентрации, а также выполнять количественную по M & M метод «до прививки" кол. В нашей клинической фонда исследований он принимает команды от 30 минут до завершения всей процедуры прививки. Pneumococcal суспензии в физиологическом растворе, как правило, показывают снизилось количество в этом интервале. Чтобы объяснить это, мы позволим разбавленный сидеть посевной при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем выполнить "пост-прививка" количественное определение бактерий M & M методом. Возьмем среднее значение до и после определения окончательной прививку концентрации. Отрегулируйте "сидит" время в соответствии с вашими клинический протокол, но сохранить интервал как можно более кратким. Все новые запасы должны быть направлены в референс-лабораторию для подтверждения чистоты на складе и идентичности. 3. Подготовка посевной Подготовка к посевной следует начинать за 30 минут до назначенного времени прививки добровольцев. Возьмите одну из ранее сделанных труб фондовом из морозильной камере -80 ° C, оттепель его и вращать трубу в микроцентрифуге при 17000 х г в течение 3 мин. Теплый кровяной агар пластины в 37 ° С инкубатор. Готовить96-луночный планшет для бактериального количественного методом M & M и подготовить разведения труб в зависимости от желаемой дозы. Снимите бульон супернатант из центрифугированных труб и ресуспендируют осадок в 1 мл физиологического раствора. Этот шаг снимает отвар из посевного материала. Повторите стадии центрифугирования. Удалить солевые супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл физиологического раствора. Выполнить набор для разведения желаемого посевной концентрации и количественно по M & M методом. Возьмем к посевной добровольцев назначения и после прививки добровольцев, повторить количественный в лаборатории. Этикетка трубки с датой и посевной дозы и хранить при температуре -80 ° C. Для обеспечения согласованности с прививкой на прививку, важно использовать те же пипетки и специального оборудования лаборатории каждый раз. 4. Прививка Добровольцы должны сидеть удобно в полу-лежачем положении. <li> Использование P200 пипетки и стерильные наконечники с фильтром составляет 100 мкл посевного и вставьте наконечник только внутри полости носа. Медленно изгнать посевной на слизистую оболочку носа помощью кругового движения. Очень важно, чтобы кончик пипетки не вступают в контакт с слизистую оболочку носа, как нарушения в целостности эпителия может привести к бактерии, попадающие в кровь. Это также важно, чтобы посевной находится не слишком далеко, или она будет работать в горло, она должна находиться внутри полости носа. Повторите для другой ноздри. У добровольцев остаться в полу-лежачем положении в течение 10 мин без нюхают или сморкании. Это дает время для бактерий, чтобы разогнать через слизистую оболочку. 5. Мониторинг Добровольцы ежедневно контролируется после прививки. Это включает в себя ежедневное текстовое сообщение, отправленное добровольцев исследователи до 2 часов. Если текст, который яы не получил к 2 часам дня волонтера будет связаться, чтобы обеспечить его / ее благополучия. Если он / она не отвечает, выделенных ближайших родственников будет связаться, чтобы обеспечить волонтеров благополучия. Волонтеры просят сообщать о любых верхних дыхательных путей симптомов на каждом назначении. Медицинский персонал будет просить добровольцев, чтобы описать его / ее симптомы и будет следить за любыми жалобами. Антибиотики уделено добровольцев только должны быть приняты в трех случаях: в случае, если они нездоровы и поручил принять их исследовательской группы, если они несут пневмококка в конце исследования, или если они нездоровы и не может связаться с исследовательской группой. Добровольца рекомендуется держать это чрезвычайное пакет с ними в течение всего времени исследования и обращаться к исследовательской группы на ежедневной основе в течение последующих 7 дней. Наша команда доступна 24/7 с медсестрой контакте в рабочее время и двум врачам доступны из хоУРС. Все вопросы решаются путем телефонного звонка и / или непосредственного обзора. Положения доступны для немедленной, прямой допуск к инфекционное отделение болезни, если это необходимо. 6. Носовые Wash (NW) процедуры Носовые моет (NW) выполняется на начальном визите скрининга, а также 48 часа, 7 и 14 дней после прививки. Метод З использованы взята из Naclerio и др. 8. Добровольцы естественно колонизирована S. пневмонии исключены из прививки и последующей деятельности. Волонтер сидит комфортно и голова наклонена назад 30 ° от вертикали. Попросите добровольца, чтобы сделать глубокий вдох и задержать дыхание в то время толкают их языком вверх и в обратном направлении по отношению к небу. Хотя в этом положении, волонтер просят сигнализировать, что они готовы. Шприц с 20 мл солевого вставляется в переднюю носовую пространства и 5 мл физиологического раствора исключен. Volunteeг, то наклоняется вперед сразу и удаляет жидкость, быстро выдыхая через нос в миску фольгой. Повторите эту процедуру еще 3 раза, так что каждый ноздри были дважды промывают и полный 20 мл были использованы. Бассейн все образцы вместе в центрифужные пробирки и отправить в лабораторию при комнатной температуре обработки. 7. Носовые Wash обработки Центрифуга образцов в течение 10 мин при 3345 х г. Удалить супернатант и хранят в 1 мл аликвоты в маркированных трубы Эппендорф при температуре -80 ° C. Добавить 100 мкл STGG среде 9 до осадок и тщательно перемешайте. Убедитесь, что общий объем в трубе в этой точке определяется. Это разбавление будет использоваться при расчете КОЕ перевозки положительные З. Пластина 20 мкл капли STGG содержащие Ресуспендированный осадок на тарелку кровяной агар содержащие гентамицин и полоса всей пластинки. Если NW это после инокуляции, 10 мкл удалить из STGG содержащие Ресуспендированный осадок и использование для бактериального количественного М & M методом. Добавить еще 800 мкл STGG к трубе NW и тщательно перемешайте. Пластина 25 мкл на тарелку кровяной агар и 25 мкл на тарелку агар шоколада, полос всей пластинки. Разделите оставшееся количество бактерий, взвешенных в STGG среднего на 2 криопробирки и хранят при температуре -80 ° C. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° С в течение ночи в 5% CO 2. Проверьте пластины на следующий день пневмококка и других потенциальных возбудителей дыхательных путей. Пневмококки определяются на пластинах по морфологии колонии. Альфа-гемолитические колонии с морфологией рисовальщика являются суб-культурного на кровяной агар с диска optochin и инкубировали в течение ночи. Фиксированные пневмококковой колоний, которые являются чувствительными optochin которые окрашивали по Грамму, чтобы подтвердить грамположительные диплококки и серотип использовании сывороток Института Pneumotest-Latex комплект.