Expérimentale transport pneumocoque humaines

1. Sélection et présélection des bénévoles Volontaires sains sont recrutés par le biais d'affiches et de publicités sur le site de l'Université en fonction de la recherche du NHS et d'éthique d'orientation. Les critères d'inclusion pour la participation sont les suivantes: Adultes de 18-60 ans. Il parle couramment l'anglais et est capable de communiquer facilement à la fois par téléphone mobile et la messagerie texte. Les critères d'exclusion de la participation sont les suivantes: Le contact étroit avec les personnes à risque (enfants, adultes immunodéprimés, personnes âgées, santé maladie chronique). Courant des antécédents de tabagisme fumeur ou significative (> 10 paquets-années). L'asthme ou autre maladie respiratoire. Grossesse. Allergie à la pénicilline ou amoxicilline. Participation actuelle à un autre essai clinique à moins que l'observation ou la non-intervention de phase. Impossible de donner un consentement éclairé. Une visite de sélection initiale, environ une semaine avant l'inoculation, comprend une histoire centrée clinique et un examen clinique ciblé. Si un non constatés antérieurement anomalie est détectée, le volontaire seront exclus de l'étude et enquête appropriée sera organisé par les soins primaires. Au cours de l'examen initial visiter un hémogramme complet est obtenu à veiller à ce que le nombre de globules blancs est dans la plage normale avant l'inoculation visite. Un lavage nasal est effectué pour exclure les transporteurs pneumocoque naturelles (voir 6.1). Avant l'inoculation, les bénévoles reçoivent une formation sur les risques inhérents à la participation à l'étude et sont fournis avec une notice destinée aux patients d'urgence, thermomètre numérique, des numéros de téléphone d'urgence et 3 jours de cours de l'amoxicilline. 2. Préparation des stocks d'inoculation Préparation des stocks d'inoculation doit être faite dans un environnement propre. Les pipettes utilisées ne doit être utiliserpour la préparation d 'inoculum. Tout verrerie et les articles en plastique doivent être stériles. Nous recommandons que les stocks d'inoculation être préparé dans une salle dédiée, en utilisant une hotte dédiée et un incubateur. Souches de pneumocoques sont ensemencées sur une gélose au sang. Les plaques sont incubées à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant la nuit. Le lendemain de toutes les bactéries est raclée de la gélose au sang et inoculé dans un système de préservation des stocks de perles. Ces stocks perles sont utilisées pour l'inoculation préparation de la pâte. Testez les stocks de perles pour la contamination et l'uniformité colonie avant de préparer un stock inoculation. Pour préparer le bouillon inoculation, inoculer une gélose au sang de deux perles du sérotype pneumococcique stock souhaité perle qui s'étirent pour couvrir la totalité de la plaque. Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant la nuit. Toutes les incubations d'autres utiliseront ces mêmes conditions. Aussi incuber les médias Vegitone nuit pour assurer la stérilité. L'écouvillon lendemain matinla moitié de la plaque, en prenant soin de ne pas enlever la gélose au sang, et ajouter à 12 ml de bouillon Vegitone préchauffé. Répéter en utilisant l'autre moitié de la plaque. Laisser les 12 deux flacons ml à 37 ° C pendant 2 heures ou jusqu'à ce qu'un changement de turbidité apparaît, selon la première éventualité. Ajouter le ml 12 à 40 ml de bouillon Vegitone préchauffé et bien mélanger. Répétez l'opération pour l'autre flacon de 12 ml. Il s'agit point dans le temps = 0. Prélever 100 ul de lire la densité optique (DO) à 600 nm. Retirer 20 ul pour la quantification des bactéries par unité formant colonie (UFC) Nombre moyen d'une variante de la méthode de Miles et Misra (M & M) 7. Incuber les deux flacons. Pour le M & M, diviser une gélose au sang en six sections. Ajouter 180 ul de PBS stérile à six puits d'une plaque de 96 puits à fond en U (). Ajouter 20 ul de bouillon pour le bien haut et bien mélanger. Diluer en série des échantillons 01h10 six fois et jeter 20 pl du puits sixième. Placer trois gouttes 10 pl du puits haut dans la première section de l'gélose au sang. Répétez l'opération pour les cinq autres puits. S'assurer que la plaque est sèche avant qu'il ne soit renversé et mis à incuber. Le lendemain, compter le nombre de colonies visibles dans chaque section de dilution et d'enregistrement. Utilisation de la section de dilution avec un nombre entre 30 et 300, il faut diviser le nombre de colonies visibles par trois pour obtenir une moyenne. Multipliez le nombre moyen de colonies par le facteur de dilution, puis divisez par 10 (le montant de la baisse de 10 pi). Cela donne UFC / ul. Multipliez ce nombre par 1000 pour obtenir UFC / ml. Effectuer DO 600 lectures et la quantification des bactéries par M & M méthode chaque heure avant le début de phase semi-logarithmique est atteint, une DO de 0,25. Une fois cette DO est atteint, ajouter 10% de glycérol stérile à un flacon et préparer aliquotes de 1 ml. Boutique aliquotes à -80 ° C. Pour un stock plus concentré, centrifuger la fiole autre à 3345 xg pendant 15 min et éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 22,5 ml d'Vegitone moyen et ajouter 10% de glycérol. Préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à -80 ° C. Laisser les stocks à -80 ° C pendant au moins 48 heures avant la décongélation et la quantification. Quantifier le stock congelé bactérienne par la méthode M & M. Testez trois tubes actions individuellement pour assurer la reproductibilité. Utilisez la valeur obtenue pour diluer le stock à la concentration désirée d'inoculum dans une solution saline, comme décrit ci-dessous. Pour l'inoculation, la quantité de pneumocoques dans l'inoculum est calculée avant et après l'inoculation. Cette quantification des bactéries par la méthode M & M est utilisé pour déterminer le nombre moyen de pneumocoques dans l'inoculum qui représente le temps qu'il faut pour terminer la procédure. Préparer un inoculum, diluer à la concentration voulue, et d'effectuer la quantification par la méthode M & M pour la "pré-inoculation" count. Dans notre centre de recherche clinique prend l'équipe de 30 min pour terminer la procédure d'inoculation entier. Pnsuspensions eumococcal dans une solution saline se montrent habituellement une diminution du nombre dans cet intervalle. Pour tenir compte de cela, nous laissez l'inoculum dilué à température ambiante pendant 30 min, puis effectuer un "post-inoculation" quantification des bactéries par la méthode M & M. Prendre la moyenne de l'avant et après afin de déterminer la concentration finale inoculé. Réglez la «séance» le temps en fonction de votre protocole clinique mais gardez l'intervalle aussi bref que possible. Tous les nouveaux stocks doivent être envoyés à un laboratoire de référence pour la confirmation de la pureté des stocks et d'identité. 3. Préparation d'inoculum Préparation de l'inoculum doit commencer 30 minutes avant le rendez-inoculation volontaire prévue. Prenez l'un des tubes d'actions déjà effectués sur le congélateur à -80 ° C, le décongeler et faire tourner le tube dans la microcentrifugeuse à 17.000 xg pendant 3 min. Gélose au sang chaud dans l'incubateur à 37 ° C. Préparerune plaque à 96 puits pour la quantification bactérienne par la méthode M & M et préparer les tubes de dilution en fonction de la dose souhaitée. Retirer le surnageant de bouillon du tube centrifugé et remettre en suspension le culot dans 1 ml de solution saline. Cette étape supprime le bouillon de l'inoculum. Répétez l'étape de centrifugation. Retirer le surnageant saline et reprendre le culot dans 1 ml de solution saline. Effectuez ensemble taux de dilution de la concentration d'inoculum désiré et quantifier par M & M méthode. Prenez l'inoculum à la nomination des bénévoles et des volontaires après l'inoculation, répéter la quantification au laboratoire. Etiqueter le tube avec la date et la dose de l'inoculum et conserver à -80 ° C. Pour assurer la cohérence de l'inoculation à l'inoculation, il est important d'utiliser les mêmes pipettes et matériel de laboratoire dédié à chaque fois. 4. Inoculation Les bénévoles doivent être assis confortablement dans une position semi-allongée. <li> En utilisant une pipette P200 et pointes à filtre stériles établir 100 pi de l'inoculum et insérez la pointe juste à l'intérieur de la cavité nasale. Lentement expulser l'inoculum sur la muqueuse nasale en utilisant un mouvement circulaire. Il est essentiel que la pointe de pipette n'entre pas en contact avec la muqueuse nasale comme une rupture dans l'intégrité de l'épithélium pourrait se traduire par des bactéries dans la circulation sanguine. Il est également essentiel que l'inoculum n'est pas placé trop loin ou elle se déroulera dans la gorge, il doit se trouver à l'intérieur de la cavité nasale. Répétez l'opération pour la narine autre. Ayez le bénévolat rester dans la position semi-couchée pendant 10 min sans renifler ou se moucher. Cette alternance permet aux bactéries de se disperser à travers la muqueuse. 5. Surveillance Les bénévoles sont surveillés par jour après l'inoculation. Cela inclut un message texte envoyé par le quotidien bénévole aux enquêteurs avant 14 heures. Si le texte que jen'est pas reçue par 14 heures le volontaire sera contacté pour assurer sa / son bien-être. Si il / elle ne répond pas, la prochaine alloué parent sera contacté pour assurer le volontaire du bien-être. Les bénévoles sont invités à rendre compte des symptômes des voies respiratoires supérieures à tous les rendez-vous. Le personnel clinique demandez au volontaire de décrire ses symptômes et ses / assurera le suivi des plaintes. Les antibiotiques donnés aux volontaires ne doivent être prises dans trois circonstances: dans le cas où ils sont malades et sont chargés de les prendre par l'équipe de recherche, s'ils sont porteurs pneumocoque à la fin de l'étude, ou si elles sont mal et incapable de communiquer avec l'équipe de recherche. Le volontaire est encouragé à maintenir cette trousse de secours avec eux pendant toute la durée de l'étude et est prié de contacter l'équipe de recherche sur une base quotidienne pour les 7 prochains jours. Notre équipe est disponible 24/7 avec contact infirmière pendant les heures de travail et de deux médecins disponibles sur des hours. Toutes les requêtes sont traitées par appel téléphonique et / ou un examen immédiat. Dispositions sont disponibles pour immédiate, admission directe dans un service des maladies infectieuses, en cas de besoin. 6. Lavage nasal (NW) Procédure Lavages nasaux (NO) sont effectuées lors d'une visite de dépistage initial, ainsi que 48 heures, 7 et 14 jours après l'inoculation. La méthode utilisée NO est tiré de Naclerio et al. 8 volontaires naturellement colonisés par S. pneumoniae sont exclus de l'inoculation et le suivi. Le volontaire doit être confortablement assis et la tête est inclinée vers l'arrière à 30 ° de la verticale. Demandez au volontaire de prendre une profonde inspiration et retiennent leur souffle tout en poussant leur langue et vers l'arrière contre le toit de la bouche. Alors que dans cette position, le volontaire est invité à indiquer qu'ils sont prêts. Une seringue remplie avec 20 ml de solution saline est inséré dans l'espace nasal antérieur et 5 ml de solution saline est expulsé. Le volunteepuis se penche en avant r immédiatement et expulse le fluide en expirant par le nez rapidement dans un bol en aluminium. Répétez cette procédure 3 fois plus de sorte que chaque narine a été lavées deux fois et la totalité des 20 ml a été utilisée. Piscine tous les échantillons ensemble dans un tube de centrifugeuse et l'envoyer au laboratoire à température ambiante pendant le traitement. 7. Nasal Wash traitement Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 3345 x g. Enlever le surnageant et conserver en aliquotes de 1 ml dans des tubes Eppendorf étiquetés à -80 ° C. Ajouter 100 ul de milieu 9 StGG au culot et mélanger soigneusement. Assurez-vous que le volume total dans le tube à ce stade est déterminé. Cette dilution sera utilisé dans le calcul de l'UFC d'un chariot positif NO. Plaque une baisse de 20 ul de la StGG contenant l'extrait concentré sur une gélose au sang contenant de la gentamicine et de série de la plaque. Si le NO est post-inoculation, 10 pl retirer de la StGG contenant le culot remis en suspension et l'utilisation pour la quantification bactérienne par M & M méthode. Ajouter une autre de 800 ul StGG au tube NO et bien mélanger. Plaque de 25 pi sur une plaque de gélose au sang et 25 pi sur une plaque de gélose chocolat, rayures toute la plaque. Divisez les bactéries en suspension dans l'montants restants StGG moyenne en 2 cryotubes et conserver à -80 ° C. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit dans 5% de CO 2. Examiner les plaques le lendemain pour le pneumocoque et d'autres pathogènes respiratoires potentiels. Les pneumocoques sont identifiés sur des plaques par la morphologie des colonies. Colonies hémolytiques alpha ayant une morphologie dessinateur sont repiqués sur gélose au sang avec un disque optochine et incubées pendant la nuit. Les colonies suspectes pneumocoque qui sont sensibles sont optochine coloration de Gram pour confirmer diplocoques à Gram positif et le sérotypage en utilisant le Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit.