実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

1。選択とスクリーニングをボランティア健康なボランティアは、NHSの研究倫理委員会のガイダンスに従ってポスター広告を通じて、大学のウェブサイト上で募集しています。 参加のための選択基準は以下のとおりです。 18から60歳の成人。 流暢な英語を話し、携帯電話やテキストメッセージの両方で容易に通信することが可能である。 参加のための除外基準は以下のとおりです。 リスク個人（子供、免疫抑制大人、高齢者、慢性病気）でと連絡を閉じます。 現在の喫煙者や重大な喫煙歴（> 10パック年）。 喘息や他の呼吸器疾患。 妊娠。 ペニシリンまたはアモキシシリンにアレルギー。 観察しない限り、または非介入段階で別の臨床試験で現在の関与。 完全にインフォームドコンセントを与えることができません。 初期スクリーニング訪問、接種する前に、約1週間は、焦点を絞った病歴とターゲット臨床検査が含まれています。 以前に認識されていない異常が見つかった場合は、ボランティアは研究から除外され、適切な調査がプライマリケアを介して配置されます。 初期スクリーニングで白血球数が接種を訪問する前に、通常の範囲内であることを確実にするために求められるフル血球数を参照してください。鼻洗浄は、（6.1を参照してください）​​自然な肺炎球菌のキャリアを排除するために行われる。 接種の前に、ボランティアが研究への参加に伴うリスクについて教育されており、救急患者のリーフレット、デジタル温度計、緊急電話番号とアモキシシリンの3日間コースが設けられている。 2。接種株の作製接種株の調製はクリーンな環境で行わなければなりません。ピペットは使用のみ使用されるべきである接種の準備のためのD。すべてのガラスやプラスチック容器は、無菌でなければならない。我々は、接種株は、専用fumehoodとインキュベーターを用いて、専用の部屋で準備することをお勧めします。 肺炎球菌の菌株は血液寒天プレート上に接種されています。プレートを5％CO 2下で一晩37℃でインキュベートする。翌日は、すべての細菌が血液寒天プレートから掻き取り、ビード株式保全システムに接種する。これらのビーズを取り揃えており、接種の在庫準備のために使用されます。接種の在庫を準備する前に、汚染やコロニーの均一性のためにビーズ銘柄をテストします。 接種の在庫を準備するには、プレート全体をカバーするためにストリーキング、希望肺炎球菌血清型ビーズストックから2ビーズで血液寒天プレートに接種する。 2晩、5％のCOで37℃でプレートをインキュベートする。それ以降のすべてのインキュベーションは、これらと同じ条件を使用します。また、無菌性を確保するために一晩Vegitoneメディアをインキュベートする。 翌朝綿棒2分の1プレートは、任意の血液寒天培地を除去し、あらかじめ温めておいたVegitoneブロスの12ミリリットルに追加しないように注意してください。プレートの残りの半分を使用して繰り返します。濁度の変化が明らかになるまで、2時間または37℃で2つの12 mLバイアルを残して、いずれか早い方。 あらかじめ温めておいたVegitoneブロス40mlに12ミリリットルを加え、よく混ぜる。他の12 mlバイアルに対して、この手順を繰り返します。これは、時点= 0です。 600nmでの光学密度（OD）を読むために100μlを削除します。マイルズとMisraの（M＆M）は7でメソッドのバリエーションを使用してコロニー形成単位（CFU）のカウントによって細菌の定量化のための20μlを削除します。両方のバイアルをインキュベートする。 M＆Mのために、6つのセクションに血液寒天プレートを分割します。 96ウェルプレートの6ウェル（U底）に滅菌PBS 180μlを添加する。トップだけでなく、ミックスにブロスの20μlを添加する。逐次サンプル一時10 6倍に希釈し、第六ウェルから20μlを捨てる。ウェルの最初のセクションに先頭から310μlの水滴を置き血液寒天プレート。 5他のウェルについて、この手順を繰り返します。それが反転してインキュベートされる前に、板が乾燥していることを確認します。 翌日は各希釈部と記録に見えるコロニー数をカウントします。 30と300の間の数で希釈セクションを使用して、平均値を得ることが3によって可視コロニー数を割る。 希釈率をコロニー数の平均値を乗算した後、10（10μlの降下量）で割ります。これは、CFU /μlで与える。 CFU / mlを得るために1000でこの数値を掛けます。 早い中間対数期に達するまで0.25のOD、毎時のM＆M法による細菌のOD 600が測定値と定量を行う。 この外径に達すると、1バイアルに滅菌10％グリセロールを追加し、1mlのアリコートを準備します。 -80℃でアリコート℃で保存しより濃縮された株式については、15分間3345 xgで他のバイアルを遠心分離し、上清を除去する。 Vegitonの22.5ミリリットルでペレットを再懸濁し電子媒体及び10％グリセロールを追加します。 -80℃で1mlアリコートとストアを準備℃に解凍および定量化する前に、少なくとも48時間、-80℃で株式を残す。 M＆Mの方法により凍結細菌株を定量化する。再現性を確保するため、個別に3在庫管をテストします。後述するように、生理食塩水で所望の接種濃度に株式を希釈するために取得した値を使用します。 接種については、接種で肺炎球菌の量は接種前と後に計算されます。 M＆M法による細菌のこの定量化は、それが全体の手順を完了するのにかかる時間を占める接種で肺炎球菌の平均数を決定するために使用されます。 所望の濃度に希釈し、接種を準備して、 "事前接種"カウントのためのM＆M法により定量を行う。 我々の臨床研究施設では、全体の接種の手順を完了するには、チームで30分かかります。 Pnは生理食塩水でeumococcal懸濁液は、通常、この間隔の減少カウントが表示されます。これを説明するために、我々は30分間室温で希釈した接種座り込みを聞かせて、その後のM＆M法による細菌の "接種後"定量を行う。 最終接種濃度を決定するために前後の平均を取る。あなたの臨床試験計画書によると、 "座っている"の時間を調整しますが、できるだけ簡潔に間隔を保つ。 すべて新株式は、株式の純度とアイデンティティの確認のための基準実験室に送られるべきである。 3。接種の準備接種物の調製は、スケジュールされたボランティアの接種の予定30分前に開始する必要があります。 -80℃の冷凍庫から以前に作成した在庫管の1を取り出し、それを解凍し、3分間17000×gで遠心チューブをスピン。 37℃インキュベーターで温かい血液寒天プレート。準備するM＆M法による細菌の定量化のための96ウェルプレートおよび所望の投与量に応じて希釈用チューブを準備します。 遠心分離チューブからブロス上清を除去し、生理食塩水1mlにペレットを再懸濁します。このステップでは、接種から培養液を除去します。 遠心ステップを繰り返します。 生理食塩水上清を除去し、生理食塩水1mlにペレットを再懸濁します。 希望接種濃度の希釈セットを実行し、M＆Mの方法により定量化する。 ボランティア予定に接種を取り、ボランティアを接種した後、ラボで定量化を繰り返します。 -80℃での日付と接種量や店舗でチューブにラベルを付け℃に接種から接種への一貫性を確保するために、それは同じピペットと専用の実験装置たびに使用することが重要です。 4。接種ボランティアは、半臥位で快適に座っすべきである。 <li> P200のピペットと滅菌フィルターチップを使用して接種の100μlを立て、ちょうど鼻腔の内側に先端を挿入します。 ゆっくりと円を描くようにして鼻粘膜に接種を追放。 それは、ピペットの先端が血流に入る細菌につながる可能性上皮の完全性の混乱として鼻粘膜に接触しないことが重要です。 これは、接種しすぎて戻されていないか、またはそれが喉を実行されることも重要であり、それは鼻腔の内側に存在する必要があります。 他の鼻孔についても同じ手順を繰り返します。 ボランティアが鼻を盗聴または吹くことなく10分間、半臥位のままで持っています。これは、細菌が粘膜を横切って分散させるための時間を確保できます。 5。監視ボランティアは、接種後に毎日監視されています。これは、午後2時前に調査官にボランティアによって送信された毎日のテキストメッセージが含まれています。 テキストiの場合sは、ボランティアが彼/彼女の幸福を確保するために接続される2時までに受け取っていない。彼/彼女が応答しない場合は、親族の割り当てられている次は、ボランティアの福祉を確保するためにご連絡させていただきます。 ボランティアは、すべての予定で任意の上気道症状を報告するように求められます。臨床スタッフは彼/彼女の症状を記述するためにボランティアをお願いし、苦情をフォローアップします。 ボランティアに与えられた抗生物質は、次の3つの状況下で撮影するだけであり、彼らが体調不良であり、彼らは研究の終了時に肺炎球菌を運ぶか、またはそれらが体調不良であればしている場合は、研究チームがそれらを取るように指示された場合に研究チームに連絡することができません。ボランティアは、試験期間中にすべての回で一緒にこの緊急パックを維持することが奨励され、次の7日間、毎日のように研究チームに連絡することを要求され​​ています。 私たちのチームは、HOのうち勤務時間中に看護師の連絡先と利用できる24/7であり、2つの医師が利用できるURS。全ての問い合わせは、電話の呼び出しおよび/または即時見直しによって対処されています。必要に応じて規定は、感染症病棟への即時、直接入学のために用意されています。 6。鼻ウォッシュ（NW）手順鼻洗浄（NW）は、最初のスクリーニング訪問と同様、48時間、7日および14日、接種後に実行されます。使用NWメソッドはNaclerio らから取得されます。8ボランティアが自然に、S.によって植民地化肺炎球菌は、接種から除外され、フォローアップされています。 ボランティアは、快適な姿勢で座っていると頭が垂直から戻って30°傾いている。 で深呼吸をして口の屋根に対して後方に自分の舌を押し上げながら、自分の息を保持するためにボランティアをお願いします。この位置にしながら、ボランティアは、彼らは準備ができていることを通知するように頼まれます。 20mlの生理食塩水を充填したシリンジは前鼻の空間に挿入され、生理食塩水5mlを追放されています。 volunteerは、その後すぐに前かがみと箔ボウルに彼らの鼻を通して急速に吐き出すことにより、流体を排出する。 この手順を各鼻孔を2回洗浄されており、完全な20ミリリットルが用いられてきたように、3回繰り返します。 遠心管中で一緒にプールのすべてのサンプルを処理し、室温で実験室に送る。 7。鼻洗浄処理 3345×gで10分間サンプルを遠心分離します。 -80℃で標識したエッペンドルフチュー​​ブに1 mlアリコートとして清とストアを削除℃にペレットに媒体9 STGGの100μlを加えてよく混合します。この時点でチューブ内の総量が決定されることを確認します。この希釈は、キャリッジ正NWのCFUを計算する際に使用されます。 プレートゲンタマイシン、ストリーク、プレート全体を含む血液寒天プレートに再懸濁したペレットを含むSTGG20μlのドロップ。 NWは、接種後の場合、再懸濁ペレットと、M＆M法による細菌の定量化のための使用を含むSTGGから10μlを削除します。 NWチューブにSTGGの別の800μlを加えてよく混合します。 血液寒天プレートとチョコレート寒天プレート上に25μlの上にプレートを25μl、プレート全体をストリーキング。 -80℃で2クライオバイアルとストアにメディアをSTGGに懸濁させ、残量の細菌を分ける℃に 5％CO 2で37℃で一晩プレートをインキュベートする。 肺炎球菌やその他の潜在的な呼吸器病原体のために翌日プレートを調べます。 肺炎球菌は、コロニー形態によりプレートで識別されます。製図形態を有するα溶血性コロニーがoptochinディスクと血液寒天培地上で継代培養され、一晩インキュベートした。 optochin小文字が区別され、推定肺炎球菌のコロニーはグラムグラム陽性diplococcusの複数形を確認するために染色し、Statens血清研究所PNEUを使用して血清型アールmotest-ラテックスキット。