Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi
Summary
Burada doku mühendisliği için farklı katmanları arasında sürekli arabirimleri ile biyouyumlu, katmanlı matrisler oluşturmak için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Böyle bir iskele çeşitli biyolojik, kimyasal ya da mekanik yardımlar yaparak hücre davranışı modüle ideal özelleştirilebilir ortamı sağlayabilir
Abstract
Türleri ve biyolojik uyarıcı (örneğin büyüme faktörleri, inhibitörler, veya küçük molekül) veya matris yapısı konsantrasyonları (örneğin, matris bileşimi, konsantrasyonu ya da sertliği), uzay içinde değişebilir olan kompleks doku kültürü matrisler araştırmalar geniş bir yelpazede izin verecek Bu değişkenler hücre farklılaşmasını, göç ve diğer fenomenler nasıl etkilediğini ilgili. Katmanlı matrisler yaratmada önemli bir sorun her katman 1 tek tek bileşenlerin difüzyon olmadan katman arayüzleri yapısal bütünlüğünü muhafaza edilir. Bunu başarmak için, Mevcut metodolojiler photopatterning 2-3, litografi 4, sıralı functionalization5, 6 dondurularak kurutulur, ve arayüz 7, ya da hangi birçok gelişmiş enstrümantasyon ve teknik beceri gerektiren santrifüj 8, içerir. Diğer katmanlar 9 delaminasyon yol açabilir bireysel katmanların, sıralı eki güveniyor </> sup.
DGMP yoğunlukları 10 değişik katmanları oluşturmak için böyle iodixanol gibi inert bir yoğunluk değiştirici kullanarak bu sorunların üstesinden. Yoğunluk değiştirici herhangi prepolimer ya da biyolojik olarak aktif molekül ile karışabilir olduğundan, DGMP her bir iskele katman özel izin verir. Bunlar sulu kalırken Bunun için yoğunluk değiştiricisi yoğunluğunu çeşitlendirerek bitişik tabakaların karıştırma önler. Müteakip tek adım polimerizasyon her katmanı ayrı kimyasal ve mekanik özelliklere sahip olduğu yapısal olarak sürekli katmanlı iskele, yol açmaktadır. Yoğunluk değiştirici kolaylıkla tek tek katmanları ya da bunların bileşenleri karışıklık olmadan yeterli çalkalama ile temizlenebilir. Bu teknik, bu nedenle de çeşitli boyutlarda, şekiller ve malzemelerin hidrojeller oluşturmak için uygundur.
Alternatif tabakalar RGDS-350 dahil edildiği bir 2D-polietilen glikol (PEG) jel, imalatı için bir protokol aşağıda verilmiştir. Biz PEG b kullanınbu biyouyumlu ve hareketsizdir ecause. Rgds, bir hücre adezyon peptid 11, biyolojik bir işaret mekansal kısıtlama göstermek için kullanılan ve bir fluorofor (Alexa Fluor 350) konjugasyon bize görsel çeşitli katmanlarını ayırt etmek mümkün kılınmaktadır. Bu işlem diğer malzemeler için adapte edilebilir (örneğin kollajen, hyaluronan, vb) ve 10 bazı değişiklikler ile 3D jeller imal uzatılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DGMP pahalı aletlerle dayanmaz katmanlı jeller hazırlamak için basit bir stratejidir. Bu protokol, kollajen ve hyaluronik asit gibi diğer biyolojik olarak uyumlu malzemeler kullanılarak, iskeleler oluşturmak için adapte edilebilir. Tabakalar arasındaki kuyruklarının karıştırma önlemek için Biyoaktif küçük moleküller, örneğin, hücre yapışma arttırıcı RGDS peptid, polimer matris için gergin edilebilir. Bunlar, matris ağ boyutuna bağlı olarak, hidrojeller ile 10 arasındaki yaymak için daha az eğilimli olduğunu Proteinler kimyasal konjugasyon için gerek kalmadan farklı katmanlar halinde yerleştirilebilir. Burada iodixanol (Nycoprep), önceden canlı hücre uygulamalar için tercih edilen bir atıl yoğunluk değiştirici kullanılmaktadır. Sukroz ve glukoz gibi diğer yoğunluk değiştiriciler de kullanılabilir. Yerleşme zamanı (t s) değiştirerek, bir ihtiyaç olarak iki katman arasındaki arabirimleri (uzun yerleşme zamanı yumuşak geçişler verir) yumuşak veya keskin geçişler üretmek için ince ayar yapabilirsiniz <> 10 sup. Örneğin, DGMP jel tabakalar arasında yumuşak geçiş örneğin kemotaksisi gibi hücre çalışma süreçleri için bir biyolojik işaret sürekli bir gradyan oluşturmak için kullanılabilir.
Jel üzerinde yoğunluk sertlik değiştirici etkileri bir% 15 jel aPEGda için, Şekil 5'te gösterilmiştir; PEGda ve iodixanol konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak sertlik ve gözeneklilik daha ayrıntılı bir tanımlama şu anda değerlendirilmektedir. Bu örnekte PEGda konsantrasyonu nispeten yüksek olsa da, bu olmadan jel ile karşılaştırıldığında% 30 iodixanol ile jeller içinde% 60 daha fazla elastik modül görülmektedir. Jel sertlik değişim modüle makromer konsantrasyon veya çapraz bağ yoğunluğu için ayarlanabilir.
Biz de poliakrilamid ve PEG öncüleri 10 kullanarak 3D katmanlı jeller oluşturmak için DGMP tekniği uyguladık. Konsantrasyon veya prepolimerin çapraz bağlanma derecesi değişen sağlayan yapısal varyasyon3D polarize büyüme ve göç gibi hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilir iskelelerinin.
Özet olarak, DGMP biyomedikal ve temel araştırmalar, geniş bir uygulama yelpazesi için biyo-uyumlu malzemeler çeşitli 2D ile 3D iskelelerinin üretmek için uygulanabilir bir uyarlanabilir bir tekniktir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar NIH Müdür'ün Yeni Yenilikçi Ödülleri (1DP2 OD006499-01 AA ve 1DP2 AJE için OD006460-01) destek ve Bilim ve Teknoloji (Nanotıp Mükemmellik UC San Diego Merkezi) King Abdulaziz City için minnettarız. Biz el yazması onu eleştirel yorumlar için Bayan Jessica Moore teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
| N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
| Sigmacote | Sigma | SL2 |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
| MALDI | Bruker | N/A |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
