Градиента плотности многослойных полимеризации (DGMP): новый метод для создания Multi-купе, Настраиваемые Строительные леса для тканевой инженерии

1. Синтез флуоресцентно меченые акрилоил-PEG-Rgds Реакция Rgds пептида с акрилоил-PEG-сукцинимидил карбоксиметил эфира (aPEG-SCM, PEG МВт: 3400 г / моль) и Н. Н. диизопропилэтиламина (DIPEA) в 1.2:1:2 молярные соотношения в диметилсульфоксид (ДМСО) в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи. Подтвердите сопряжение матрицы-активированной лазерной десорбции / ионизации времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Добавить 1 мкл aPEG-Rgds реакционного раствора на образец пятно на целевую MALDI и сухой. Подготовка насыщенным раствором универсального MALDI матрицы в тетрагидрофуране (ТГФ) и вихря в течение 1 мин. Добавить ~ 1 мкл этого раствора на том же месте образца. Повторите процедуру для aPEG-SCM для сравнения. Загрузите и анализировать. Молекулярная масса aPEG-Rgds должно быть больше, чем aPEG-SCM (рис. 2). Для сопряженных флуорофора, добавить эквимолярного количества Alexa Fluor 350 карбоновой кислоты (succinimydyl эфир), растворенныйв минимальном объеме ДМСО, в aPEG-Rgds реакционного раствора с 1,1 и реагируют в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение ночи. Очищают aPEG-Rgds-350 от диализа (MW 3500 Да) против DI-H 2 O при температуре 4 ° С в течение 48 ч при объемном соотношении 1000:1, обмен диализата по крайней мере, дважды в день. Замораживание сухой очищенный aPEG-Rgds-350 в Labconco Freezone Plus или эквивалент сухого замораживания системы и хранят при температуре -20 ° C. 2. Подготовка 2D форм и изготовление 2D гель ПЭГ с переменным Rgds-350 Слои Подготовьте предметные стекла гидрофобной. Поместите чистые предметные стекла в стеклянной посуде в вакуумной печи. Нагреть до 80 ° С в течение 30 мин до полного высыхания поверхности. Место блюдо с горки в вытяжном шкафу и добавить 250 мкл Sigmacote для каждого слайда, осторожно покачивая в течение 30 секунд, чтобы покрыть всю поверхность. Тщательно промойте покрытием слайды со 100% метанола, с последующей промывкой в ​​дистиллированной воде, впитывая в два раза в течение 5 мин в лизингт 10 мл. Вырезать силиконовые прокладки (0,8 мм) с 10 мм удары биопсии. Автоклав силиконовые прокладки и Sigmacote обработанных предметные стекла. Формулировка решения для каждого соответствующего слоя в отдельных труб микроцентрифуге путем смешивания PEG диакрилат (PEGda) предшественника (конечная концентрация 15% вес / объем) с различным количеством иодиксанол (60% раствор в воде) с получением различных конечных концентраций (например, 40%, 30%, 20% и 10%), дополняя остальные тома с фосфатным буферным раствором (PBS) для получения решения градуированных плотности. Аналогичным образом, для чередующихся слоев, смешать aPEG-Rgds-350 (конечная концентрация 8 мМ) с иодиксанол и PBS для получения различных концентраций (например, 35%, 25% и 15%). Добавить фотоинициатора (2-гидрокси-4'-(2-гидрокси)-2-methylpropiophenone, 333mg/ml складе в N-винилпирролидон) для каждого решения для различных слоев (10 мкл раствора в мл каждого слоя раствора). Фотоинициатора яс добавлен последним для предотвращения полимеризации до слоев гелей в форме, так как он чувствителен к свету. Последующие этапы этого протокола будет выполнена в шкафу биобезопасности для обеспечения стерильности. Фильтр-стерилизовать каждого решения с помощью стерильного шприца 1 мл и 0,2 мкм. Соберите установку по форме сэндвич прокладку между двумя Sigmacore обработанных стеклах и безопасную зажимы размещения, как показано на рисунке 1. В ролях слоистых гелей, добавив самой густой раствор (например, PEGda с 40% иодиксанол) первым, а затем менее плотный раствор (например aPEG-Rgds-350 с 35% иодиксанол). Повторите дополнительное иерархическое для достижения нескольких слоев требуемого состава и плотности, как показано на рисунке 1. Облучать формы с 365 нм свет в течение 3 минут с помощью портативного UVR-9000 ламп. Разрешить полимеризоваться гели для лечения в течение 5 мин. Снимите зажимы, затем осторожно поднимите верхнее стеклослайдов и плесени; стратифицированную гели DGMP останется на слайдах. С помощью стерильного шпателя, осторожно поместите гелей в 50 мл пробирку, содержащую стерильный ФСБ или культуральной среды для стирки. Вымойте полимеризованный гелей в PBS в объемном соотношении 1000:1, обмен буфер по крайней мере, два раза в день, чтобы удалить плотность модификатора, фотоинициатор, и непрореагировавших полимеров. Кроме того, PBS может быть обменен с клеточной среде роста. Хранить DGMP гелей в PBS или питательной среды для эксперимента культуры клеток, изложенных в пункте 3. Для визуализации чередующихся слоев, организовать DGMP гель (эти гели не будут использоваться для культивирования клеток) вдоль линейки на образец лоток документации блока гель VersaDoc. Expose гелей в 350 нм, время экспозиции будет варьироваться в зависимости от концентрации флуорофора. Чередующихся темных и синих полос в DGMP гидрогель продемонстрировать формирования отдельных слоев различных химического состава (рис. 3). <p class="Jove_title"> 3. 2D культуре клеток на гели DGMP Для включения гели Rgds пептид, использовать сцепление зависимых клеток, таких как C2C12 миобластов. Аккуратно вставьте DGMP гели (хранится в PBS) в лунки 48-луночных культуре клеток пластины, используя стерильные скребком ячейки в кабинет биобезопасности. Предварительно теплой питательной среды (среда Игла, модифицированной Eagle или DMEM с добавлением 10% об / об эмбриональной телячьей сыворотки и 1% V / V 100x пенициллина-стрептомицина раствора) и PBS в водяную баню при температуре 37 ° C. Вымойте 60% сливной пластины (10 мм) C2C12 клеток в три раза с PBS. Аспирируйте с PBS и урожай клеток путем добавления 1 мл 0,25% трипсина-EDTA и инкубации при температуре 37 ° С в течение 2 мин. Ресуспендируют клеток в среде, рост и количество клеток. Семенной DGMP гель-содержащих клеточных культур хорошо с C2C12 миобластов (20.000 клеток / см 2). Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% CO 2/95% относительной влажности. Аккуратно обмен среду после 4 часов, осторожно, чтобы не повторнодвигаться легко придерживаться клеток. После 24 часов, крепление C2C12 миобластов на Rgds содержащих слои DGMP гели могут быть подтверждены эпифлуоресцентной и фазового контраста микроскопии (Zeiss Axiovert 200).