Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis ​​para Engenharia de Tecidos

1. Síntese de acriloílo marcado por fluorescência-PEG-RGDS Reagir o péptido RGDS com éster carboximetil acriloil-PEG-succinimidil (APEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) e di-isopropiletilamina NN (DIPEA) em razões molares 1.2:1:2 em sulfóxido de dimetilo (DMSO) sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente durante a noite. Confirmar conjugação por laser assistida por matriz tempo de dessorção / ionização de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa. Adicionar 1 ml de APEG-RGDS solução de reacção a uma mancha de amostra no alvo MALDI e seco. Prepara-se uma solução saturada de Universal MALDI Matrix em tetra-hidrofurano (THF) e agitar em vortex durante 1 min. Adicionar ~ pi 1 desta solução à mancha mesma amostra. Repita o procedimento para APEG-SCM para comparação. Carregar e analisar. O peso molecular de APEG-RGDS deve ser superior a APEG-SCM (Figura 2). Para conjugar o fluoróforo, adicionar uma quantidade equimolar de Alexa Fluor 350 carboxílico (éster succinimydyl), dissolvidosnum volume mínimo de DMSO, a solução de reacção APEG-RGDS de 1,1 e reagir sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente durante a noite. Purificar APEG-RGDS-350 por diálise (PM 3500 Da) contra DI O 2-H, a 4 ° C, durante 48 horas à razão volumétrica 1.000:1, trocando dialisado pelo menos duas vezes por dia. Congelar a secar purificado APEG-350-RGDS em um Labconco Freezone Plus ou sistema equivalente congelamento seco e armazenar a -20 ° C. 2. Preparação de um Molde de 2D e fabricação de um gel 2D com PEG-350 RGDS alternada Camadas Preparar lâminas de vidro hidrofóbicas. Colocar as lâminas de vidro limpas em um prato de vidro num forno de vácuo. Aquecer a 80 ° C durante 30 minutos para secar completamente as superfícies. Lugar prato com lâminas em um exaustor e adicionar 250 ul Sigmacote a cada slide, balançando suavemente por 30 segundos para a superfície revestimento inteiro. Enxaguar bem as lâminas revestidas com 100% de metanol, seguido de lavagem em água destilada, duas vezes por imersão durante 5 minutos em em least de 10 ml. Cortar espaçadores de silicone (0,8 mm de espessura), com 10 milímetros de biópsia perfuradores. Autoclavar os espaçadores de silicone e slides Sigmacote tratados com vidro. Formular soluções para cada respectiva camada, em tubos de microcentrífuga individuais, de mistura de PEG diacrilato (PEGda) precursor (concentração final de 15% w / v) com quantidades diferentes de iodixanol (solução-mãe a 60% em água), para se obterem diferentes concentrações finais (por exemplo, 40%, 30%, 20% e 10%), completando o volume restante com tampão fosfato salino (PBS) para obter soluções de densidades calibradas. De uma maneira semelhante, por camadas alternadas, mistura APEG-RGDS-350 (concentração final de 8 mM) com PBS e iodixanol, para se obter várias concentrações (por exemplo, 35%, 25% e 15%). Adicionar fotoiniciador (2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona, estoque 333mg/ml em N-vinil-pirrolidona) a cada solução por várias camadas (10 ul de solução de reserva por ml de cada solução de camada). Fotoiniciador is adicionados no final para evitar a polimerização antes estratificação dos géis no molde, uma vez que é sensível à luz. Etapas subseqüentes deste protocolo será realizado em uma cabine de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Filtra-esterilizar cada solução utilizando uma seringa estéril ml e um filtro de 0,2 um. Montar a configuração do molde por ensanduichando o espaçador entre duas lâminas de vidro tratadas com Sigmacore e seguras com grampos colocação, conforme ilustrado na Figura 1. Converter os géis em camadas, adicionando a solução mais denso (por exemplo PEGda com iodixanol 40%) em primeiro lugar, seguido por uma solução de menor densidade (por exemplo, APEG-RGDS-350 com iodixanol 35%). Repita as camadas alternadas de atingir várias camadas de composição desejada e densidades, como mostrado na Figura 1. Irradiar o molde com luz de 365 nm, durante 3 min usando um portátil UVR-9000 da lâmpada. Permitir que os géis polimerizados curar durante 5 min. Remova os grampos, em seguida, levantar delicadamente a parte superior de vidroslides e do molde, os géis dGMP estratificadas permanecerá nos slides. Usando uma espátula estéril, colocar cuidadosamente os géis em tubo de 50 ml de PBS estéril contendo meio de cultura ou para a lavagem. Lavar os géis polimerizados em PBS a 1.000:1 razão volumétrica, a troca de tampão de pelo menos duas vezes por dia, para remover o modificador de densidade, fotoiniciador, e um polímero que não reagiu. Alternativamente, PBS pode ser trocado com meio de crescimento celular. Armazenar os géis dGMP em PBS ou meio de crescimento para a cultura de células de ensaio descrito no Passo 3. Para visualizar camadas alternadas, organizar DGMP gel (esses géis não poderá ser usado para cultura de células) ao longo de uma régua na bandeja de amostra de uma unidade de documentação de gel VersaDoc. Expor o gel em 350 nm, o tempo de exposição pode variar, dependendo da concentração do fluoróforo. Alternando bandas escuras e azul no hidrogel DGMP demonstrar a formação de camadas discretas da composição química diferente (Figura 3). <p class="Jove_title"> 3. Cultura de Células 2D sobre geles dGMP Para geles incorporando péptido RGDS, utilização de células dependentes da aderência, tais como mioblastos C2C12. Insira cuidadosamente géis dGMP (armazenadas em PBS) nas cavidades de placas de 48 poços de cultura de células, utilizando um raspador de células estéril numa câmara de biossegurança. Pré-aquecer o meio de crescimento (meio de Dulbecco modificado por Eagle ou DMEM suplementado com 10% v / v de soro fetal de bovino e de v / v de 1% 100x solução de penicilina-estreptomicina) e PBS num banho de água regulado a 37 ° C. Lavar a placa de 60% confluentes (10 mm) de células C2C12 três vezes com PBS. Aspirar PBS e as células de colheita por adição de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C durante 2 min. Ressuspender as células em meio de crescimento e células de contagem. Semente da DGMP gel contendo a cultura de células bem com mioblastos C2C12 (20.000 células / cm 2). Incubar as células a 37 ° C em 5% CO2 / 95% de humidade relativa. Gentilmente meio de troca, após 4 horas, cuidado para não voltarmover levemente células aderidas. Após 24 h, a fixação de mioblastos C2C12 sobre as camadas que contêm RGDS de géis dGMP pode ser confirmado por epifluorescência e microscopia de contraste de fase (Zeiss Axiovert 200).