Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l'ingegneria tissutale

1. Sintesi di marcato in modo fluorescente Acryloyl-PEG-Rgds Reagiscono con il peptide Rgds acriloil-PEG-succinimidil carbossimetil estere (APEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) e NN diisopropiletilammina (DIPEA) a 1.2:1:2 rapporti molari in dimetilsolfossido (DMSO) sotto argon a temperatura ambiente durante la notte. Confermare coniugazione da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF), spettrometria di massa. Aggiungere 1 ml di APEG-Rgds soluzione di reazione in un punto campione sul target MALDI e asciutto. Preparare una soluzione satura di universale MALDI Matrix in tetraidrofurano (THF) e vortex per 1 min. ~ Aggiungere 1 ml di questa soluzione a punto del campione stesso. Ripetere la procedura per APEG-SCM per il confronto. Caricare e analizzare. Il peso molecolare di APEG-Rgds dovrebbe essere maggiore di APEG-SCM (Figura 2). Di coniugare il fluoroforo, aggiungere una quantità equimolare di Alexa Fluor 350 carbossilico (succinimydyl estere), discioltoin un volume minimo di DMSO, al APEG-Rgds soluzione di reazione da 1,1 e reagire sotto argon a temperatura ambiente per una notte. Purificare APEG-Rgds-350 da dialisi (MW 3500 Da) contro il DI-H 2 O a 4 ° C per 48 ore a 1.000:1 rapporto volumetrico, lo scambio di dialisato almeno due volte al giorno. Congelare asciugare la purificato APEG-Rgds-350 in Freezone Labconco Plus o Blocco del sistema equivalente a secco e conservare a -20 ° C. 2. Preparazione di uno stampo 2D e Realizzazione di un gel PEG 2D con alternata Rgds-350 Livelli Preparare vetrini idrofobiche. Posizionare vetrini puliti in un piatto di vetro in un forno a vuoto. Riscaldare a 80 ° C per 30 minuti per asciugare completamente le superfici. Luogo piatto con le diapositive in una cappa aspirante e aggiungere 250 microlitri Sigmacote a ogni diapositiva, delicatamente a dondolo per 30 sec alla superficie cappotto intero. Sciacquare i vetrini rivestiti con 100% metanolo, seguita da lavaggio con acqua distillata, ammollo due volte per 5 min in a least 10 ml. Tagliare distanziali in silicone (0,8 mm di spessore) con 10 mm pugni biopsia. Autoclave i distanziali in silicone e Sigmacote trattati con vetrini. Formulare soluzioni per ciascun rispettivo strato in provette per microcentrifuga singoli mescolando PEG diacrilato (PEGda) precursore (concentrazione finale 15% w / v) con diverse quantità di iodixanolo (soluzione stock 60% in acqua) per produrre concentrazioni finali diverse (ad esempio il 40%, 30%, 20% e 10%), che completa il volume residuo di tampone fosfato (PBS) per ottenere soluzioni di densità differenziate. In modo simile, per strati alternati, mix APEG-Rgds-350 (concentrazione finale 8 mm) con iodixanolo e PBS per produrre concentrazioni diverse (ad esempio 35%, 25%, e 15%). Aggiungi fotoiniziatore (2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone, magazzino 333mg/ml in N-vinil pirrolidone) per ogni soluzione per vari strati (10 pl di soluzione madre per ml di ciascuna soluzione di strato). Fotoiniziatore is ultimo aggiunto per prevenire la polimerizzazione prima stratificazione dei gel nello stampo, in quanto è sensibile alla luce. I passi successivi di questo protocollo sarà effettuata in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. Filtro-sterilizzare ogni soluzione sterile utilizzando una siringa da 1 ml e 0,2 micron. Assemblare l'impostazione stampo intramezzando il distanziatore tra due Sigmacore trattati vetrini e sicure con fascette ponendo come illustrato in Figura 1. Gettare i gel strati aggiungendo la soluzione più densa (es. PEGda con il 40% iodixanolo) prima, seguita da una soluzione meno densa (es APEG-Rgds-350 con 35% iodixanolo). Ripetere la stratificazione alternate per ottenere diversi strati di composizione desiderata e densità come mostrato in Figura 1. Irradiare lo stampo con la luce 365 nm per 3 minuti con un portatile UVR-9000 lampada. Consentire i gel polimerizzati per curare per 5 min. Rimuovere i morsetti, quindi sollevare delicatamente il vetro superiorediapositiva e lo stampo, i gel DGMP stratificate rimarrà nelle diapositive. Utilizzando una spatola sterile, posizionare accuratamente il gel in una provetta da 50 ml contenente PBS sterile o mezzo di coltura per il lavaggio. Lavare il gel polimerizzato in PBS a 1.000:1 rapporto volumetrico, lo scambio di buffer di almeno due volte al giorno per rimuovere il modificatore densità, fotoiniziatore, e polimero che non ha reagito. In alternativa, PBS può essere scambiato con il terreno di crescita. Conservare i gel DGMP in PBS o terreno di coltura per l'esperimento di coltura cellulare indicato al punto 3. Per visualizzare strati alternati, organizzare gel DGMP (questi gel non saranno utilizzabili per colture cellulari) lungo un righello sul vassoio campione del meccanismo di documentazione gel VersaDoc. Esporre i gel a 350 nm, il tempo di esposizione varia a seconda della concentrazione del fluoroforo. Alternando bande scure e blu nell'idrogel DGMP dimostrano formazione di strati distinti di composizione chimica diversa (Figura 3). <p class="Jove_title"> 3. Colture Cellulari 2D su gel DGMP Per i gel che incorporano peptide Rgds, usare le cellule di adesione dipendenti, ad esempio mioblasti C2C12. Inserire delicatamente gel DGMP (memorizzati in PBS) nei pozzetti di piastre di coltura cellulare a 48 pozzetti utilizzando un raschietto sterile cella in un armadio biosicurezza. Pre-riscaldare terreno di crescita (terreno Eagle modificato da Dulbecco o DMEM supplementato con 10% v / v di siero fetale bovino e 1% v / v 100x soluzione di penicillina-streptomicina) e PBS in un bagno d'acqua a 37 ° C. Lavare una piastra 60% confluenti (10 mm) di C2C12 tre volte con PBS. Aspirare off PBS e cellule raccolto aggiungendo 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 2 min. Risospendere le cellule in mezzo di crescita e cellule di conteggio. Il seme DGMP gel-coltura cellulare contenente bene con mioblasti C2C12 (20.000 cellule / cm 2). Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2/95% di umidità relativa. Delicatamente mezzo di scambio, dopo 4 ore, fare attenzione a non rispostare leggermente cellule aderenti. Dopo 24 ore, il sequestro conservativo di mioblasti C2C12 sui Rgds contenenti strati di gel DGMP può essere confermata da epifluorescenza e microscopia a contrasto di fase (Zeiss Axiovert 200).