Gradient de densité multicouche de polymérisation (DGMP): une nouvelle technique pour la création multi-compartiment, échafaudages personnalisables pour l'ingénierie tissulaire

1. Synthèse de l'marquées par fluorescence Acryloyl-PEG-RGDS Faire réagir le peptide RGDS avec acryloyl-PEG-succinimidyl ester carboxyméthylique (aPEG-SMC, PEG MW: 3400 g / mol) et NN diisopropyléthylamine (DIPEA) dans des rapports molaires 1.2:1:2 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), sous argon, à température ambiante pendant une nuit. Confirmer la conjugaison par laser assistée par matrice de désorption / ionisation de temps de vol (MALDI-TOF) par spectrométrie de masse. Ajouter 1 ml de solution réaction aPEG-RGDS à une tache d'échantillon sur la cible MALDI et sec. Préparer une solution saturée de Universal MALDI Matrix dans le tétrahydrofurane (THF) et le vortex pendant 1 min. Ajouter environ 1 ul de cette solution à l'endroit même échantillon. Répétez la procédure pour aPEG-SCM pour la comparaison. Charger et analyser. Le poids moléculaire de aPEG-RGDS doit être supérieure à aPEG-SCM (Figure 2). À conjuguer le fluorophore, ajouter une quantité équimolaire d'Alexa Fluor 350 acide carboxylique (ester succinimydyl), dissousdans un volume minimal de DMSO, à la solution réactionnelle aPEG-RGDS de 1,1 et à réagir sous atmosphère d'argon à température ambiante pendant une nuit. Purifier aPEG-RGDS-350 par dialyse (MW 3500 Da) contre DI-H 2 O à 4 ° C pendant 48 heures à rapport volumétrique 1000:1, l'échange de dialysat au moins deux fois par jour. Congelez sécher le purifiée aPEG-RGDS-350 dans un Labconco Freezone plus ou le système de gel équivalent sec et conserver à -20 ° C. 2. Préparation d'un moule de fabrication 2D et d'un gel de PEG 2D avec alternance Rgds-350 Couches Préparer des lames de verre hydrophobes. Placez lames de verre propres dans un plat en verre dans un four sous vide. La chaleur à 80 ° C pendant 30 min pour sécher complètement les surfaces. Lieu plat avec les diapositives d'une hotte et ajouter 250 ul Sigmacote à chaque diapositive, balançant doucement pendant 30 secondes à la surface de manteau tout entier. Bien rincer les lames recouvertes avec du méthanol à 100%, suivi d'un lavage à l'eau distillée, le trempage deux fois pendant 5 min dans au LEAt 10 ml. Couper entretoises en silicone (0,8 mm d'épaisseur) avec 10 poinçons de biopsie mm. Autoclaver les entretoises en silicone et des lames de verre Sigmacote traités. Formuler des solutions pour chaque couche respective dans des microtubes individuels par mélange PEG diacrylate (PEGDA) précurseur (concentration finale 15% v / v) avec différentes quantités de l'iodixanol (solution mère à 60% dans l'eau) pour obtenir des concentrations finales variant (par exemple 40%, 30%, 20% et 10%), complétant le volume restant avec du tampon phosphate salin (PBS) pour obtenir des solutions de densité à gradient. De la même manière, pour les couches alternées, mélange aPEG-RGDS-350 (concentration finale de 8 mM) avec iodixanol et PBS pour obtenir des concentrations différentes (par exemple, 35%, 25% et 15%). Ajouter photo-initiateur (2-hydroxy-4'-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone, stock 333mg/ml en N-vinylpyrrolidone) à chaque solution pour différentes couches (10 ul de solution mère par ml de chaque solution de couche). Photoinitiateur is ajouté en dernier pour éviter la polymérisation avant la superposition des gels dans le moule, car elle est sensible à la lumière. Les étapes suivantes de ce protocole sera effectué dans une enceinte de biosécurité pour garantir la stérilité. Filtrez-stériliser chaque solution à l'aide d'une seringue de 1 ml stérile et filtre de 0,2 um. Assembler le réglage de moule en prenant en sandwich l'élément d'espacement entre deux lames de verre imprégnées et Sigmacore avec des colliers de placer comme illustré à la figure 1. Jeter les gels couches en ajoutant la solution la plus dense (par exemple PEGDA avec iodixanol 40%) en premier, suivi par une solution moins dense (par exemple aPEG-RGDS-350 avec iodixanol 35%). Répétez la réalisation alternative de couches pour atteindre plusieurs couches de composition souhaitée et la densité comme le montre la figure 1. Irradier le moule avec de la lumière à 365 nm pendant 3 min en utilisant un portable UVR-9000 lampe. Laisser les gels polymérisés durcir pendant 5 min. Retirer les pinces, puis soulevez doucement le dessus en verretoboggan et le moule, les gels DGPM stratifiés restera sur les diapositives. En utilisant une spatule stérile, placer soigneusement les gels dans un tube de 50 ml contenant du PBS stérile ou milieu de culture pour le lavage. Laver les gels polymérisés dans du PBS à 1,000:1 rapport volumétrique, l'échange de tampon au moins deux fois par jour pour éliminer le modificateur de densité, photo-initiateur, et le polymère qui n'a pas réagi. En variante, PBS peut être échangé avec un milieu de croissance cellulaire. Stocker les gels DGPM dans du PBS ou un milieu de croissance pour l'expérience de culture cellulaire décrit à l'étape 3. Pour visualiser des couches alternées, organiser gel DGMP (ces gels ne seront pas utilisables pour la culture cellulaire) le long d'une règle sur le plateau d'échantillons d'une unité VersaDoc documentation de gel. Exposer les gels à 350 nm, le temps d'exposition varie en fonction de la concentration du fluorophore. Une alternance de bandes sombres et bleu dans l'hydrogel DGMP démontrer la formation de couches discrètes de composition chimique distincte (figure 3). <p class="Jove_title"> 3. Culture cellulaire 2D sur gels DGPM Pour les gels incorporant peptide RGDS, utiliser des cellules d'adhérence dépendants, tels que myoblastes C2C12. Insérez doucement gels DGPM (stocké dans du PBS) dans les puits de plaques à 48 puits de culture cellulaire en utilisant un grattoir à cellules stérile dans une enceinte de sécurité biologique. Milieu de croissance pré-chaud (milieu de Dulbecco modifié Eagle ou DMEM supplémenté avec 10% v / v de sérum de veau fœtal et 1% v / v 100x solution de pénicilline-streptomycine) et de PBS dans un bain-marie réglé à 37 ° C. Laver une plaque 60% de confluence (10 mm) de cellules C2C12 trois fois avec du PBS. Aspirer PBS et les cellules de récolte en ajoutant 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C pendant 2 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance et des cellules de comptage. Ensemencer la DGMP gel contenant de la culture cellulaire et avec des myoblastes C2C12 (20.000 cellules / cm 2). Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2/95% d'humidité relative. Moyen d'échange doucement au bout de 4 h, attention à ne pas redéplacer légèrement cellules adhérentes. Après 24 h, la fixation des myoblastes C2C12 sur les couches RGDS contenant des gels DGPM peut être confirmé par épifluorescence et microscopie à contraste de phase (Zeiss Axiovert 200).