التدرج الكثافة متعدد الطبقات البلمرة (DGMP): تقنية جديدة لإنشاء موضوع متعدد المقصورة، السقالات للهندسة الأنسجة تخصيص
Summary
نحن هنا وصف استراتيجية فريدة من نوعها لخلق حيويا، المصفوفات الطبقات مع واجهات المستمر بين طبقات متميزة لهندسة الأنسجة. يمكن لهذه السقالة توفير بيئة مثالية للتخصيص لتعديل سلوك الخلية عن طريق إشارات مختلفة البيولوجية أو الكيميائية أو الميكانيكية
Abstract
ومصفوفات معقدة زراعة الأنسجة، في أي نوع من أنواع وتركيزات من المحفزات البيولوجية (مثل عوامل النمو، ومثبطات، أو جزيئات صغيرة) أو هيكل المصفوفة (على سبيل المثال تكوين، والتركيز، أو صلابة من المصفوفة) تختلف على الفضاء، وتمكين طائفة واسعة من التحقيقات بشأن كيفية هذه المتغيرات تؤثر تمايز الخلايا، والهجرة، وغيرها من الظواهر. التحدي الرئيسي في خلق مصفوفات الطبقات والحفاظ على السلامة الهيكلية واجهات طبقة دون انتشار المكونات الفردية من كل طبقة 1. المنهجيات الحالية لتحقيق ذلك ما يلي photopatterning 2-3، الطباعة الحجرية 4، functionalization5 متتابعة، وتجميد التجفيف 6، على microfluidics 7، أو الطرد المركزي 8، العديد من الأجهزة المتطورة التي تتطلب والمهارات التقنية. الاعتماد على الآخرين المرفقات من طبقات متتابعة الفردية، والتي قد تؤدي إلى طبقات التبطين 9 </سوب>.
DGMP يتغلب على هذه القضايا باستخدام معدل كثافة خاملة مثل iodixanol لخلق طبقات متفاوتة من الكثافة 10. يمكن أن تكون مختلطة منذ المعدل الكثافة مع أي سابق البلمرة أو جزيء النشطة بيولوجيا، DGMP يسمح تخصيص كل طبقة سقالة. ببساطة تركيز متفاوتة من معدل الكثافة يمنع الاختلاط بين الطبقات المجاورة في حين أنها لا تزال مائي. البلمرة اللاحقة خطوة واحدة يؤدي إلى سقالة متعددة الطبقات المستمر هيكليا، والذي لديه كل طبقة متميزة الكيميائية والخواص الميكانيكية. يمكن المعدل الكثافة إزالتها بسهولة مع الشطف كافية دون اضطراب من طبقات الفردية أو مكوناتها. ولذلك هذه التقنية مناسبة تماما لخلق الهلاميات المائية من مختلف الأحجام والأشكال والمواد.
ويرد على بروتوكول للافتعال 2D-البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هلام، في أي الطبقات بالتناوب دمج RGDS-350، أدناه. نستخدم PEG بecause من حيويا والخاملة. يستخدم RGDS، والتصاق الخلايا الببتيد 11، لإثبات تقييد المكاني للجديلة البيولوجية، واقتران من fluorophore (اليكسا فلور 350) تمكننا من التمييز بين الطبقات المختلفة بصريا. ويمكن تكييف هذا الإجراء لمواد أخرى (مثل الكولاجين، hyaluronan، الخ) ويمكن تمديدها لصنع المواد الهلامية 3D مع بعض التعديلات 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
DGMP هي استراتيجية بسيطة لإعداد المواد الهلامية التي متعدد الطبقات لا تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لإنشاء السقالات باستخدام مواد حيويا الأخرى، مثل الكولاجين وحمض الهيالورونيك. النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة، على سبيل المثال خلية التصاق المعززة للRGDS الببتيد، يمكن مصطفة على البوليمر لمنع اختلاط بين طبقات العظة. يمكن تغليف البروتينات في طبقات متميزة دون الحاجة لتصريف المواد الكيميائية لأنها، تبعا لحجم فتحات الشباك مصفوفة، هي أقل عرضة للنشر من خلال الهلاميات المائية 10. المستخدمة هنا نحن iodixanol (Nycoprep)، وهو معدل كثافة خاملة، والتي سبق استخدامها في تطبيقات خلايا قابلة للحياة. ويمكن أيضا معدلات الكثافة أخرى مثل السكروز وسكر العنب يمكن استخدامها. من خلال تغيير الوقت تسوية (ر ق)، ويمكن للمرء أن ضبط واجهات بين طبقتين لإنتاج الانتقال السلس الحاد أو حسب الحاجة (مرة يعطي سلاسة تسوية تعد التحولات) <سوب> 10. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم أكثر سلاسة الانتقال بين طبقات هلام DGMP لإنشاء الانحدار المستمر لجديلة البيولوجية لدراسة عمليات الخلية مثل الكيميائي.
يظهر تأثير معدل الكثافة على تصلب هلام في الشكل (5) لهلام aPEGda 15٪؛ توصيف أكثر اكتمالا من الصلابة والمسامية بوصفها وظيفة من وتركيزات PEGda iodixanol يجري حاليا تقييمها. في حين أن تركيز PEGda في هذا المثال مرتفع نسبيا، لاحظنا ومعامل مرونة أكبر 60٪ في المواد الهلامية مع iodixanol 30٪ مقارنة مع المواد الهلامية دون. ويمكن تعديل التغيير في تصلب هلام عليها تحوير أو تركيز macromer الكثافة يشابك.
لقد طبقنا أيضا تقنية DGMP لخلق 3D باستخدام المواد الهلامية متعدد الطبقات بولكرلميد والسلائف PEG 10. تركيز متفاوتة أو درجة يشابك من سابق البلمرة يسمح التباين في الهيكليةالسقالات، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف السلوك الخلية مثل النمو والهجرة الاستقطاب في 3D.
وخلاصة القول، DGMP هو أسلوب للتكيف التي يمكن تطبيقها على افتعال السقالات 2D و 3D من مجموعة متنوعة من المواد حيويا لمجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث الطبية الحيوية الأساسية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ممتنون للدعم من الجوائز NIH المدير الجديد المبتكر (1DP2 OD006499 AA-01 لو1DP2 OD006460-01 لAJE)، ومدينة الملك عبد العزيز للعلوم والتقنية (جامعة كاليفورنيا في سان دييغو مركز التميز في لطب النانوي). نود أن نشكر السيدة جيسيكا مور على تعليقاتها الهامة على المخطوطة.
Materials
| Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
| N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
| Sigmacote | Sigma | SL2 |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
| MALDI | Bruker | N/A |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
