Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

Ein. Synthese von fluoreszenzmarkierten Acryloyl-PEG-RGDS Reagieren des RGDS-Peptids mit Acryloyl-PEG-Succinimidyl carboxymethylester (APEG-SCM, PEG MG: 3400 g / mol) und NN Diisopropylethylamin (DIPEA) in 1.2:1:2 Molverhältnisse in Dimethylsulfoxid (DMSO) unter Argon bei Raumtemperatur Übernachtung. Bestätigen Konjugation durch Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie. Hinzufügen 1 ul APEG-RGDS Reaktionslösung zu einer Probe Fleck auf das MALDI-Target und trocken. Bereiten Sie eine gesättigte Lösung von Universal MALDI Matrix in Tetrahydrofuran (THF) und Vortex für 1 min. Fügen Sie ~ 1 ul dieser Lösung auf die gleiche Probe vor Ort. Wiederholen Sie den Vorgang für APEG-SCM für den Vergleich. Laden und zu analysieren. Das Molekulargewicht APEG-RGDS sollte größer sein als APEG-SCM (Abbildung 2). Um das Fluorophor konjugiert, fügen eine äquimolare Menge von Alexa Fluor 350 carbonsäure (succinimydyl Ester), gelöstin einem minimalen Volumen von DMSO, die RGDS-APEG Reaktionslösung von 1,1 und reagieren unter Argon bei Raumtemperatur über Nacht. Läutern APEG-RGDS-350 durch Dialysieren (MW 3500 Da) gegen DI-H 2 O bei 4 ° C für 48 h bei 1.000:1 Volumenverhältnis, Austauschen Dialysat wenigstens zweimal pro Tag. Freeze Dry das gereinigte APEG-RGDS-350 in einer Labconco Freezone Plus oder gleichwertige Freeze Dry-System und bei -20 ° C. 2. Herstellung eines 2D-Mold und Anfertigung einer 2D PEG Gel mit alternierenden Schichten RGDS-350 Bereiten hydrophoben Glasträger. Zeigen sauberes Glas gleitet in einer Glasschale in einem Vakuumofen. Wärme auf 80 ° C für 30 min vollständig trocknen die Flächen. Platz Teller mit Folien in einer Abzugshaube und 250 ul Sigmacote zu jeder Folie, sanft schaukelnden für 30 sec zu beschichten gesamte Fläche. Gründlich die beschichteten Objektträger mit 100% Methanol, gefolgt von Waschen in destilliertem Wasser, Einweichen zweimal für 5 min in bei Leasingt 10 ml. Cut Silikon-Abstandshalter (0,8 mm dick) mit 10 mm Biopsieausstanzungen. Autoklaven werden die Silikon-Abstandshalter und Sigmacote behandelten Objektträger. Formulierung von Lösungen für jedes jeweilige Schicht in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen durch Mischen PEG-diacrylat (PEGDA) Vorstufe (Endkonzentration 15% w / v) mit unterschiedlichen Mengen von Iodixanol (60% ige Stammlösung in Wasser) in unterschiedlichem Endkonzentrationen (zB 40% zu ergeben, 30%, 20% und 10%) zur Ergänzung der restliche Volumen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), um Lösungen von abgestuften Dichten zu erhalten. In einer ähnlichen Weise, zum alternierenden Schichten, um Mischung APEG-RGDS-350 (8 mM Endkonzentration) mit Iodixanol und PBS zu ergeben verschiedenen Konzentrationen (z. B. 35%, 25% und 15%). Hinzufügen Fotoinitiator (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon, 333mg/ml stock in N-vinylpyrrolidon) zu jeder Lösung für verschiedene Schichten (10 ul Stammlösung pro ml jeder Schicht Lösung). Photoinitiator is zuletzt zugegeben, um die Polymerisation vor Schichtung der Gele in der Form zu verhindern, da sie lichtempfindlich ist. Nachfolgende Schritte dieses Protokoll wird in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten. Filtern sterilisieren jede Lösung mit einer sterilen 1-ml-Spritze und 0,2 um Filter. Montieren Sie den Werkzeug-Setups durch Anordnen der Abstandhalter zwischen zwei Sigmacore behandelten Glasplatten und mit Zwingen befestigen Platzierung wie in Abbildung 1 dargestellt. Warf die geschichteten Gele, indem das dichteste Lösung (zB PEGDA mit 40% Iodixanol) zunächst durch eine weniger dichte Lösung (zB APEG-RGDS-350 mit 35% Iodixanol) gefolgt. Wiederholen des alternativen Schichtung mehrere Schichten von gewünschten Zusammensetzung und Dichten zu erzielen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Bestrahlen der Form mit 365 nm Licht für 3 min unter Verwendung eines tragbaren UVR-9000 Lampe. Lassen Sie die polymerisierte Gele für 5 min zu heilen. Entfernen Sie die Klammern, dann heben Sie die obere GlasRutsche und die Form, die geschichtete DGMP Gele werden auf den Folien bleiben. Mit einem sterilen Spatel, vorsichtig die Gele in einem 50 ml Röhrchen mit sterilem PBS oder Kulturmedium für Wäsche. Waschen der polymerisierten Gele in PBS bei 1.000:1 Volumenverhältnis, Austauschen Puffer mindestens zweimal pro Tag das Dichtemodifikationsmittel, Photoinitiator und nicht umgesetztem Polymer zu entfernen. Alternativ kann PBS mit Zellwachstumsmedium ausgetauscht werden. Speichern der DGMP Gele in PBS oder Wachstumsmedium für die Zellkultur Experiment in Schritt 3 beschrieben. Um abwechselnden Schichten visualisieren, zu veranlassen DGMP Gel (diese Gele nicht verwendbar für die Zellkultur) entlang einer Lineal auf der Probenschale eines VersaDoc Geldokumentation Einheit. Setzen der Gele in 350 nm; die Belichtungszeit variiert in Abhängigkeit von der Konzentration des Fluorophors. Abwechselnd dunklen und blauen Streifen im DGMP Hydrogel demonstrieren Bildung von diskreten Schichten aus verschiedenen chemischen Zusammensetzung (Abbildung 3). <p class="Jove_title"> 3. 2D Cell Culture auf DGMP Gels Für Gele Einbeziehung RGDS-Peptid, verwenden Adhäsion abhängigen Zellen, wie C2C12 Myoblasten. Schieben Sie DGMP Gele (gespeichert in PBS) in die Vertiefungen der 48-Well-Zellkultur-Platten mit einer sterilen Zellschaber in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Vorwärmen Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium oder DMEM, ergänzt mit 10% v / v fötalem Rinderserum und 1% v / v 100x Penicillin-Streptomycin-Lösung) und PBS in ein Wasserbad gesetzt bei 37 ° C Waschen mit 60% konfluenten Platte (10 mm) von C2C12 Zellen dreimal mit PBS. Absaugen PBS und Ernte Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 2 min. Die Zellen in Wachstumsmedium und Anzahl Zellen. Samen der DGMP Gel enthaltenden Zellkultur gut mit C2C12 Myoblasten (20.000 Zellen / cm 2). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2/95% relative Luftfeuchtigkeit. Gently Tauschmittel nach 4 h, aufpassen, nicht wiederBewegen leicht anhaftenden Zellen. Nach 24 Stunden kann die Anbringung von C2C12 Myoblasten auf den RGDS-haltigen Schichten DGMP Gele durch Epifluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskopie (Zeiss Axiovert 200) bestätigt werden.