密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

1。蛍光標識アクリロイル-PEG-RGDSの合成室温でアルゴン下、ジメチルスルホキシド（DMSO）のモル比で1.2:1:2とNNジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）アクリロイル-PEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（3400グラム/モルaPEG-SCMは、PEG MW）とRGDSペプチドを反応一晩。 飛行のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析法によって共役を確認してください。 MALDIターゲットとドライでの試料スポットにaPEG-RGDS反応液の1μlを添加します。ユニバーサルMALDIマトリックスのテトラヒドロフラン（THF）と1分間ボルテックスの飽和溶液を調製します。同じサンプルのスポットにこのソリューションの約1μlを添加する。比較のためにaPEG-SCMの手順を繰り返します。ロードし、分析します。 aPEG-RGDSの分子量はaPEG-SCM（ 図2）より大きくなければなりません。 蛍光色素を結合するために、溶解のAlexa Fluor 350カルボン酸（succinimydylエステル）の等モル量を追加DMSOの最小容量で、1.1からaPEG-RGDS反応溶液に、室温で一晩アルゴン下で反応する。 日当たり少なくとも二回透析液を交換し、1,000:1体積比で48時間、4℃でのDI-H 2 Oに対して（MW 3500 Da）は透析によってaPEG-RGDS-350を精製する。 精製LabconcoフリーゾーンPlusまたは同等のフリーズドライシステムでaPEG-RGDSを-350、-20℃で保存をフリーズドライ 2。 RGDS-350層を交互に使用した2DのPEGゲルの2Dモールドと製作の準備疎水性ガラススライドを準備します。真空オーブン内のガラス皿にきれいなガラススライドを配置します。 80熱が°Cで30分間完全に表面を乾燥させる。場所はドラフト内でスライドと皿と優しくコート表面全体に30秒間揺らし、各スライドに250μlのSigmacoteを追加します。徹底的にLEAがでで5分間ずつ2回浸漬し、蒸留水で洗浄した後、100％メタノールでコーティングされたスライドをすすぎトン10ミリリットル。 10ミリメートル生検パンチでシリコーンスペーサー（0.8mm厚）を切り取ります。 シリコーンスペーサーとSigmacote処理したスライドガラスをオートクレーブ。 最終濃度（ 例えば 40％、変化得イオジキサノールの異なる量（水中60％原液）と混合PEGアクリレート（PEGDA）前駆体（最終濃度15パーセントw / v）のことで、個々のマイクロチューブ内の各々の層のための解決策を策定する30％、20％と10％）、リン酸塩残量を補うことは傾斜密度の解を得るために、緩衝生理食塩水（PBS）。同様にして、交互層のために、イオジキサノールおよびPBSでミックスaPEG-RGDS-350（終濃度8 mm）が様々な濃度（ 例えば 35％、25％、15％）を得た。 様々な層（各層の溶液1ml当たりの株式溶液10μl）の各溶液に（2 – ヒドロキシ-4'-（2 – ヒドロキシエトキシ）-2 – メチルプロピオフェノン、N-ビニルピロリドンで333mg/ml株）光開始剤を追加します。光開始剤Isは光に敏感であるように、金型内のゲルの階層化する前に重合を防止するために最後に追加された。 このプロトコルの後続ステップは、無菌性を確保するためにバイオセーフティキャビネット内で実行されます。 滅菌した1mlシリンジおよび0.2μmフィルターを用いて、各溶液をろ過滅菌を。 2 Sigmacore処理されたガラススライド、 図1に示すように配置するクランプとの安全の間にスペーサーを挟むことにより、金型設定を組み立てます。 密度の低い溶液（35％イオジキサノールと例えば aPEG-RGDS-350）に続く最初の最も密な溶液（40％イオジキサノールと例えば PEGDA）を追加することで、階層化ゲルをキャストします。 図1に示すように、所望の組成と密度のいくつかの層を達成するために代替の階層化を繰り返します。 ポータブルUVR-9000ランプを使用して3分間365nmの光でモールドを照射します。重合したゲルは、5分間硬化させることを許可します。クランプを外し、そっと上部のガラスを持ち上げるスライドやカビ、成層DGMPゲルは、スライド上に残ります。無菌のスパチュラを使用して、慎重に滅菌PBSまたは洗浄用培地を含む50 mlチューブにゲルを置きます。 密度調節剤、光開始剤、及び未反応のポリマーを除去するために一日に少なくとも二回バッファを交換し、1,000:1体積比でPBS中の重合ゲルを洗浄します。代わりに、PBSを細胞増殖培地と交換することができる。 PBSまたはステップ3で概説細胞培養実験のための増殖培地中DGMPゲルを保管してください。 交互層を可視化するために、VersaDocゲルドキュメンテーションユニットのサンプルトレイ上の定規に沿ってDGMPゲル（これらのゲルは、細胞培養のため使用できません）を手配。 350 nmのゲルを公開。露光時間は、フルオロフォアの濃度に応じて異なります。 DGMPヒドロゲル中に濃い青とバンドを交互に異なる化学組成（ 図3）の離散的な層の形成を実証している。 <p class="jove_title"> 3。 DGMPゲル上での2Dセルカルチャー RGDSペプチドを組み込んだゲルは、そのようなC2C12筋芽細胞などの接着依存性細胞を使用しています。 ゆっくりバイオセーフティキャビネット内で無菌のセルスクレイパーを用いて48ウェル細胞培養プレートのウェルにDGMPゲル（PBS中に保存）を挿入します。 プリ暖かい増殖培地（10％v / vのウシ胎児血清および1％v / vの100xのペニシリン – ストレプトマイシン溶液を補充したダルベッコ改変イーグル培地またはDMEM）およびPBS 37℃に設定した水浴℃で PBSでC2C12細胞3倍の60％コンフルエントのプレート（10 mm）を洗浄します。 0.25％トリプシン-EDTAの1mlを添加し、2分間37℃でインキュベートすることにより、PBSおよび収穫細胞を吸引。増殖培地とカウント細胞で細胞を​​再懸濁する。 C2C12筋芽細胞（20,000細胞/ cm 2）と同様にゲル含有細胞培養DGMPシード。 5％CO 2/95％相対湿度で37℃で細胞をインキュベートします。再しないように注意してください4時間後にそっと交換媒体、軽く接着した細胞を移動します。 24時間後、DGMPゲルのRGDS含有層上にC2C12筋芽細胞の付着は落射蛍光および位相差顕微鏡（ZEISS AXIOVERT 200）で確認することができる。