Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em> In Utero</em> Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon
Summary
Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.
Abstract
Somatik kök hücreler erişkin 1 sırasında embriyonik gelişim ve doku homeostazını sırasında doku oluşumu için esastır ek kök hücreler (genişletme) veya daha fazla farklılaşmış hücre tipleri (farklılaşma) oluşturmak için bölebilirsiniz. Şu anda, büyük çabalar bu rejeneratif tıp 1,2 için yeni stratejiler geliştirebilmek için oldukça önemli olduğuna inanılmaktadır çünkü farklılaşma genişleme somatik kök hücre anahtarını kontrol doğru yatırım vardır. Bununla birlikte, kök somatik hücre çalışma ve kullanımı önemli bir zorluk, genişleme kontrol etmek çok zor olduğu kanıtlanmıştır olmasıdır.
Burada cdk4/cyclinD1 kompleks ifadesi, G1 faz önemli bir düzenleyici işleyerek fare embriyonik korteks veya yetişkin hipokampus sinir kök / projenitör hücre kontrolü (tamamen NSC olarak anılacaktır) genişleme sağlayan bir sistem açıklanmaktadır hücre döngüsü ve somatik kök hücre differentiation 3,4. Özellikle, iki farklı yaklaşım cdk4/cyclinD1 kompleks in vivo olarak NSC aşırı eksprese edildiği de anlatılmıştır. Ilk yaklaşım olarak, hücre siklus düzenleyicileri ekspresyonu fare telencephalon lümeninde cdk4/cyclinD1 şifreleyen plazmit arasında episomal ifadesi tetikler, böylece lateral korteks MGK onları teslim utero elektroporasyon içinde izledi enjekte edilerek elde edilir transgenlerin 5-8. İkinci yaklaşım olarak, yüksek derecede konsantre HIV-türetilmiş virüs steriotaksik 9 enfekte hücrelerin genomuna entegre viral yapının sonra hücre döngüsü düzenleyicileri oluşumsal ekspresyonu tetikleme, böylece, erişkin fare hipokampusun dentat girus enjekte edilir. Olan temel ilkeleri zaten diğer video protokolleri 10-14 tarafından tarif edilmiştir Her iki yaklaşım da, burada i optimize edildi), ii doku hasarını azaltmak) çok özel bir beyin regio hedefi geniş bölümlerins, iii) her bir bölge dahilinde işletilen hücrelerin yüksek sayıda elde etmek, ve iv) her bir hücre içinde transgenlerin yüksek ifade seviyeleri tetikler. Iki yaklaşım kullanılarak transgenlerin geçici aşırı nedeniyle Cre-ifade sırasıyla, MGK loxP siteleri tarafından çevrili cdk4/cyclinD1 taşıyan virüsleri ile enfekte 9,15 hücre bölünmesi veya tamoksifen kullanımı için electroporated plazmidler doğal seyreltme ile yani farklı yollarla elde edilir .
Bu yöntemler akut ve doku-özellikle fare beyin herhangi bir gen ekspresyonu işlemek için çok güçlü bir platform sağlar. Özellikle, cdk4/cyclinD1 kompleksi ifade işleyerek, bizim sistem sonuçta memeli beynindeki nöronlar üretilen sayısının arttırılması, böylece, temporal NSC genleşme kontrolü ve farklılaşması için kendi geçiş sağlar. Bizim yaklaşımımız temel araştırmalar için çok önemli olduğu ve tedavi için somatik kök hücreleri kullanarak olabilirMemeli merkezi sinir sisteminin i daha iyi bir anlayış) sunarken somatik kök kullanarak) yetişkinlik, iii sırasında) gelişimi, ii sırasında daha bilişsel işlevlerde yetişkin nöron rolü, ve belki, iv) doku homeostazında doku oluşumu için hücre katkısı kök nörodejeneratif hastalıkların modellerinde hücreler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utero elektroporasyon in için hayati bir adım elektrik alanların teslimi sırasında yönlü göç şarjı bağlıdır yana DNA kalite ve saflık olduğunu. Gibi endotoksinler gibi ek yüklü moleküllerin çıkarılması dahil değildir DNA arıtma için Protocols Düşük uygulama giden doğal DNA negatif yük maskeleme yol açabilir. Açıktır ki, mümkün olduğunca yakın hedef alınacak bölgeye elektrotlar ile uterin duvarlara dokunmadan elektroporasyon verimliliğini artıracaktır. Aynı derecede önemli olan bu optimum elektrik alanların teslimat için esastır beri kullanılan elektrotlar kalitesidir. Göz ve / veya benzeri serum izleri, lipidler, ve benzeri gibi organik artıklar, tarafından bile görünmez mikro-çizikleri, kaçınılmaz olarak kendi özelliklerini kaybetmeden elektrotlar giden zaman içinde birikir. Eski ve / veya kirli electropes elektroporasyon verimlilik ani bir düşüş en olası nedeni vardır ve böylece r olmalıdıren kısa sürede bu fark olarak eplaced. Nispeten daha basit olmakla birlikte, uterus elektroporasyon tipik olarak tatmin edici bir şekilde ve yeniden üretilebilir sonuçların elde edilmesi için çalışma içinde bir kaç hafta gerekmektedir. Bu gelişen embriyonun her organ ve doku için, hemen uygulanabilir, çünkü bu tekniği çok yönlüdür. Kuşkusuz, beyin gibi bir kaviteye içeren organlar ve hedef DNA, görece geniş bir hacim enjekte etme kolaylığı nedeniyle, transfekte edilmiş hücreleri bir oranını sağlamak için özellikle kolaydır.
Stereotaksik viral enjeksiyon kurulmasında karşılaşılan yaygın bir sorun kaç enfekte hücreleri ve / veya istenmeyen alanlarda hedeflemektir. İlk sorun çoğunlukla düşük titrede virüs enjeksiyonu ile ilişkilidir. Kültür pasajların düşük sayı ile 293T hücreleri daha hızlı büyür ve daha yüksek viral titreleri yol. Ca daha eski hücreleri kullanarak. 20 pasajlar önerilen ve en az% 80 verimlilik ile aktarılmasının anlamına değil iyi bir garanti vermezviral üretimi. Viral pelet yeniden süspanse edilmesi de önemlidir, viral süspansiyon kılcal kaçınılması gerekir tıkamak homojen olabilir ve viral kümeleri görünmesini sahiptir. Virüsler sıcaklığı düşer ve uzun süreli depolama için çok duyarlıdır. Bu nedenlerden ötürü, aynı hacimde kalıcı olarak -80 ° C'de saklanabilir ve refrozen olamaz gerekir. Hatta bu koşullar altında, enfektivite bir azalma depolama 6-12 ay sonra tespit edilebilir. Öğrenme aşamaları, her bir viral hazırlama viral titresi test etmek ve uzun süreli depolamadan sonra tekrar yapmak öneririz. Beynin istenmeyen bölgelerde enfekte hücrelerin varlığı biraz pratik gerektirir stereotaksik çerçeve üzerinde fare kafası suboptimal konumlandırma bağlı olabilir. Buna ek olarak, aksi takdirde kesin olmayan enjeksiyon ile sonuçlanan, pial yüzey üzerinde doğru bir şekilde 0 sıfırlamak için mümkün olmayacaktır çünkü kafatası üzerinde delik açma sırasında beyin yüzeyine zarar vermemek için kritik önem taşır. KoordinatlarıBu protokolde sağladığı C57/BL6 6-10 hafta eski kadın adlandırılır ve biz farklı suşu / yaş / cinsiyet için onları optimize etmenizi öneririz. Bu tekniğin kazanılması virüsler hazırlamak ve örnekleri analiz etmek için gerekli uzun evreleri nedeniyle utero elektroporasyon daha fazla zaman gerektirebilir. Önemle fare cerrahi ve stereotaksik enjeksiyon güvenilir ve tekrarlanabilir hale geldikten sonra virüs sadece kullanılır öneririz. Bunu başarmak için ilk adım ötenazi fareler gibi Hoechst 33342 gibi hücre geçirgenler DNA'nın boyalar, enjekte ve hemen beyinleri analiz etmektir.
Utero elektroporasyon ve stereotaksik viral enjeksiyon olarak iki güçlü akut sistemleri ve doku-spesifik memeli gelişimi ve yetişkinlik döneminde sinir sistemindeki gen ekspresyonu işlemek vardır. Hücrelerin sadece bir alt hedefleme kendi sınırlamaya rağmen bu sistemler, benzeri görülmemiş bir hız sağlamak ve daha geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında kolaylığı, itransgenik farelerin n özellikle zahmetli ve zaman alıcı nesil. Ancak bu benzerliklere rağmen, çeşitli farklılıklar bahsedilmeye değer iki teknik arasında var. Bu DNA enjekte edilir karıncık sınırlayan tek hücreler, çünkü İlk olarak, rahim elektroporasyon, farklı hücre tiplerinin hedefleme ile ilgili olarak başlangıçta uygun kök hücreler (glia hücreleri aynı zamanda radyal olarak da adlandırılır) ve transfeksiyon yol açar. Hücre bölünmesinin bir sonucu olarak, plazmid daha sonra bunların öncül ve / ya da zamanın bir fonksiyonu olarak korteks boyunca, transfekte edilmiş hücreleri dağıtılması yol açan sinirsel yavru hücrelere hedeflenen, ana kök hücreleri, miras edilecektir. Buna karşılık, yetişkin beyin HIV lentiviruses kullanımı kök hücreleri, öncü hücrelerden, nöronlar gibi olgun glial hücreler de dahil olmak üzere herhangi bir hücre tipi eşzamanlı enfeksiyona yol açar. Not, daha yaygın olarak kullanılan retrovirüsler karşıt olarak, HIV lentiviruses kullanılarak ilgili olmasıdırO lentiviral entegrasyonu dolayısıyla yetişkin, sessiz kök hücrelerinin de hedefleme sağlayan bağımsız hücrelerin mitotik devletten oluşacak.
İkincisi, elektroporasyon ve viral enfeksiyonu arasındaki bir başka önemli fark, ikinci elde enfekte hücrelerin genomundaki DNA geri dönülmez bütünleşme aksine bir geçiş, episomal ifadesi eski elde olmasıdır. Birbirini takip eden hücre bölünmesi, electroporated plazmid seyreltme, ve ektopik SiklinD1 protein yıkımı bir sonucu olarak, her bir hücre döngüsünde izleyecek. Bu etki birkaç ay (yayınlanmamış sonuçlar) sürer bulunmuştur yetişkin beyin içinde iken Böylece, embriyonik gelişimi sırasında MGK genişleme sadece son yaklaşık iki gün için 15 ile gösterilmiştir.
I) cdk4/cyclinD1 gelişimi sırasında) işlenen nöral öncüllerinden daha uzun G1 ve ii olan hücreleri üzerinde güçlü bir etkisi vardır beri Üçüncüsü, uzun bir hücre döngüsü vardırtersi yetişkinlik döneminde de geçerlidir ederken dışındakilerden kök hücre, bizim iki manipülasyonlar yetişkinlik döneminde kalkınma ve kök hücre sırasında nöral progenitörlerinin genişlemesi, öncelikle, tetiklemek için bulunmuştur. Her iki durumda da nöronlar bir artış her iki yöntem ile elde edilmiştir.
Dördüncü olarak, viral enjeksiyon kolayca sadece stereotaksik koordinatlar değiştirerek, yetişkin beyin pek çok farklı bölgeler içinde, güvenilir ve tekrarlanabilir, gerçekleştirilebilir. Buna karşılık, uterus içinde elektroporasyon yoluyla bu gibi beyin sapı, hipokampal oluşumunun ya da spinal kord gibi merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde, kesin hedefleme çoğaltılabilir şekilde elde etmek için daha fazla zor olabilir. Stereotaksik enjeksiyon herhangi bir yaştaki fareler üzerinde yapılabilir iken Ayrıca, uterus içinde elektroporasyon optimum performans için E16 E11 yaklaşık sınırlıdır. Öncesinde E11 Adımlarını bir ultrason backscatter mikroskop 18,19 kullanımı ya da bir bütün embriyo kült ya gerektirecektirure sistemi 17,20.
Kendi çalışma ve manipülasyon yeni hücre tabanlı rejeneratif tedaviler geliştirmeye yönelik temel olduğu düşünülmektedir, çünkü son, somatik kök hücrelerin temel hücre biyolojisi artan bir ilgi teşvik edilmiştir. Cdk4/cyclinD1 ekspresyonu için, özellikle bizim protokol transitorily erişkin beyninde üretilen nöron sayısını artırmak amacıyla in vivo MGK genişleme (Şekil 3B ve C ve 4B ve C) artırmak için bir araç sağlar. Biz bu manipülasyon iyi beyin gelişimi, evrim ve homeostasis yanı sıra bilişsel işlev veya sinir dejenerasyonu ya da yaralanma kurtarma katkıları içinde MGK'nın rolünü anlamak için farklı bağlamlarda bir dizi önemli olabilir inanıyoruz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Rejeneratif Terapiler, TU Dresden Tıp Fakültesi ve DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezi SFB655 (alt proje A20) Merkezi tarafından desteklenmiştir. BA kazılar-BB programı, Dresden bir burs ile desteklenmiştir. Biz Dr teşekkür ederim. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie ve utero elektroporasyon ve stereotaksik viral enjeksiyon kurulmasını sırasında değerli tavsiye Ravi Jagasia.
Materials
| Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain–using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
