Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em> In Utero</em> Electroporation of Viral stereotactische injectie

Opmerking vooraf Operatie moet worden uitgevoerd door volledig opgeleide onderzoekers na goedkeuring van de lokale autoriteiten voor het welzijn van dieren. Alle voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om de pijn en stress veroorzaakt bij het dier, ook diepe anesthesie, toediening van postoperatieve analgesie en voor operaties die langer dan 10 min, de toepassing van een oog smeermiddel aan de cornea uitdroging en blindheid te voorkomen minimaliseren. Verdoofde muizen moet voortdurend warm bij 37 ° C tot volledig herstel en elk chirurgisch gereedschap en oplossing moet steriel zijn. Hoewel het gebruik van een biologische kap is niet strikt noodzakelijk is, moet de exploitant alle redelijke voorzorgsmaatregelen om de mogelijkheid van het infecteren van de dieren tijdens de operatie door het dragen van een laboratoriumjas, masker en handschoenen te minimaliseren. Ook moet elke stap met betrekking tot de productie en het gebruik van virussen worden toegestaan ​​en moet worden uitgevoerd in S2 gebieden aanwijzen volgens de voorschriften van de plaatselijke autoriteiten.Ten slotte moet een grondige reiniging van alle gereedschappen en oppervlakken die had kunnen zijn in contact met virussen worden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde faciliteit desinfectie praktijken (voor HIV door bestrijken met 70% Et-OH en / of behandeling in een autoclaaf). Deel 1: Uitbreiding van embryonale NSC 1. In utero elektroporatie Na kloneren transgenen (ie cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) of pDSV-mRFPnls vectoren 16, zuiveren de plasmiden met EndoFree kit en resuspendeer in steriele PBS tot een concentratie van 3-5 ug / ul. Al snel voor de operatie, meng de plasmiden met 0,05% FastGreen in PBS bij een uiteindelijke verhouding van ca. 4:04:01 en centrifugeer het mengsel gedurende 2 min bij 16.000 xg te verwijderen alle neerslaat. Laad het DNA mengsel in een eerder getrokken borosilicaatglas capillair. Trekken parameters met behulp van een P-97 pipet trekker zijn: pull: 200; vel: 140; tijd: 140. Warmte wordt door een hellingbaan test en afhankelijk van de specific veel capillairen gebruikt. Monteer de capillaire op het mondstuk van de PicoPump die dicht bij de in utero elektroporatie platform (Figuur 1A) en, onder een stereomicroscoop, buig de punt en nick het op het buigpunt. Steriliseer alle chirurgie gereedschap op een droge glaskraal sterilisator en diep een zwangere muis verdoven op dag 12-15 van de dracht met behulp van een isofluraan vaporizer. Plaats het dier in rugligging op een verwarming platform ingesteld op 37 ° C en een voortdurend onderzoek isofluraan bestuur door middel van een neuskegel. Scheren de huid van de buik, desinfecteren met Betaisodona meerdere malen, eventueel afvegen tussen met 70% ethanol en subcutaan injecteren buprenorfine (verdund in PBS) bij 0,1 mg / kg concentratie pre-emptieve analgetische. Met behulp van fijne schaar, een 2 cm langssnede van de huid en, vervolgens, van de onderliggende spierwand van de buikholte te openen. Afvullen in de peritoneale holte ca. 2IUE ml oplossing (D-PBS bevattende 100 U / ml pen / strep) voorverwarmd bij 37 ° C en bewaar de oplossing in een verwarmingsblok. Bedek de muis met steriele drap met een scheur waaruit de baarmoeders verwijderd. Trek de incisie met behulp van een wolfraam oprolmechanisme, identificeren van de baarmoeder en trek deze vast te houden met een pincet tussen aangrenzende embryo's (Figuur 1B, links) en tenslotte leg het op de steriele drap. Gedurende de hele operatie, spoel de baarmoeder met IUE oplossing van het orgaan en lichaamsholte hydrateren en uitdroging van het dier. Behandel de baarmoeder voorzichtig vast te houden tussen duim en wijsvinger en draai een embryo tot de kop zichtbaar is en gericht op de gebruiker. Identificeer de telencephalic hemisferen en injecteer een van hen van de dorso-laterale zijde. Laat 1 tot 2 pi van het DNA oplossing met de voetschakelaar van een PicoPump totdat de ventrikel wordt weergegeven door FastGreen (Figuur 1B; rechts). <li> Place de anode van de elektroden op de injectieplaats en de kathode aan de contralaterale zijde (figuur 1C) en 6 pulsen van 30 V gedurende 50 ms leveren met 950 ms interval tussen elke puls met een electroporator genereren vierkante elektrische velden bediend door middel van een voetschakelaar. Vermijd het plaatsen van de elektroden in de buurt van de placenta, dit kan bloeding en schade aan het embryo veroorzaken. Als alle embryo's worden geïnjecteerd en geëlektroporeerd, terug te plaatsen de baarmoeder in de buikholte en sluit de gespierde wanden met een hechting koord hechten om de 3-4 mm. De knopen moet goed aan de spier maar niet te strak om een ​​kleine zwelling van het weefsel mogelijk te maken. Tot slot sluit de bovenliggende huid met behulp van metalen clips. Desinfecteer de huid met Betaisodona, verwijdert u de muis van de isofluraan masker en breng deze in een behuizing kooi toen helemaal wakker. Monitor het herstel van de muis tot locomotorisch gedrag is normaal. 2. Verwerking van de samPLE Een of meer dagen na elektroporatie offeren de muis, verzamel de embryo's te identificeren die kunnen geëlektroporeerd met een fluorescent stereomicroscoop (Figuur 1D). Ontleden de hersenen op ijskoude PBS en overnacht bevestig ze in 4% PFA (paraformaldehyde in fosfaat buffer pH 7,4). Uiteindelijk kan BrdU worden toegediend voordat het offer volgens verschillende paradigma's te kinetiek van de celcyclus en celproliferatie 3 te onderzoeken. De hersenen worden vervolgens voor het snijden en immunokleuring voor de verschillende markers radiale glia, voorlopers en basale neuronen (Pax6, Nestin, tbr2, TBR1, Tuj1 etc.) om het effect van de functionele transgenen evalueren gerichte NSC en hun nageslacht die die de expressie van de co-geëlektroporeerde reportergen. Figuur 1.In utero elektroporatie. (A) Schematische weergave van een in utero elektroporatie platform. (B) tekeningen van de positionering van de zwangere muis tijdens chirurgie (rechts) en injectie van het DNA / FastGreen mengsel (blauw) in de telencephalic halfrond van een muis embryo (links). (C) schema dat de plaatsing van de elektroden in contact met de baarmoeder muren met de anode (+) naast de plaats van injectie (blauw). Pijlen geven de migratie van het DNA naar de anode. (D) Foto van een muis embryo 24 uur na elektroporatie met GFP plasmiden op embryonale dag 13. Stippellijn bakent de telencephalic halfrond. Regeling in een aangepaste uit Calegari et al.., 2004 17. Deel 2: Uitbreiding van Adult NSC 1. Productie van HIV-afgeleide virusdeeltjes Dag 1: plaat 5 x 10 6 293T cellen op een 10 cmschotel met 8 ml D-MEM bevattende 10% warmte geïnactiveerd foetaal bovien serum en 100 U / ml pen / strep (kweekmedium). Gebruik 15 schotels voor een viraal preparaat en kweek overnacht bij 37 ° C, 5% CO2. Dag 2: bij elke schotel Verdun in 1 ml normaal D-MEM 5 ug van elk van drie plasmiden die coderen voor i) VSVG (vesiculair stomatitis virus type G) manteleiwit, ii) gag / pol (groepsspecifieke antigen / polymerase) en iii) een polycistronisch construct dat de functionele en reporter transgenen (ie cdk4/cyclinD1/GFP) eerder gekloneerd in een HIV-overdracht gebaseerd vector (p6NST90) 9. Meng deze oplossing met 1 ml D-MEM bevattende 45 pi polyethyleenimine die vooraf werd in PBS opgelost bij 1 mg / ml voorraadoplossing, en incubeer 15-30 minuten bij kamertemperatuur. In de tussentijd Verwijder het medium uit de cellen en voeg 4 ml per schotel vers D-MEM bevattende 15% warmte geïnactiveerd foetaal bovien serum en 100 U / ml pen / strep. Voeg 2 ml transfectie mengsel en overnacht cultuur. Dag 3: voeg 120 ul van 500 mM Na-butyraat per schotel naar de expressie van de transgenen verbeteren, meng en cultuur voor 6-8 uur waarna het transfectie medium vervangen door 5 ml kweekmedium. Dag 4: verzamel de supernatanten (ca. 70 ml totaal), passeren door een 0,22 urn filter en overdracht in 2 polyallomer centrifugebuizen (35 x 89 mm). Ultracentrifuge bij 110.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C met een swing rotor. Verwijder het supernatant, voeg 6 ml PBS aan elke buis en incubeer op ijs gedurende 1 uur. Resuspendeer de pellet en breng deze over in een polyallomer centrifugebuis (14 x 95 mm). Ultracentrifuge bij 110.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C met een swing rotor. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 50 ul PBS, 5 ul aliquots en bewaar maken bij -80 ° C. Virustiter zal in het traject van 10 8 -10 9 cfu / ml. (Opmerking: virussen zijn zeer gevoelig voor temperatuur en opslag AVOid opnieuw invriezen, te houden op droog ijs tijdens het transport en ontdooien snel voor gebruik.) 2. Stereotaxische injectie Verdoven een 6-10 weken oude muis met isofluraan en plaats het dier in buikligging op een stereotaxisch frame (Figuur 2A) met de oor bars en het gehemelte steun vast te zetten het hoofd. Het dier wordt warm gehouden op een verwarming pad ingesteld op 37 ° C en onder constante isofluraan administratie. Injecteer subcutaan 100 ul van buprenorfine werkende oplossing als pre-emptive pijnstillende, scheren een streep van de huid op de kop van de muis en desinfecteren, zoals beschreven in 1.4. Met behulp van een scalpel, maak een ca. 1,5 cm lange longitudinale incisie op de hoofdhuid blootstellen van de schedel ter hoogte van de pijlnaad. Trek de huid en zachtjes het bot oppervlak schoon met een steriel wattenstaafje. Half-Vul een glazen capillaire (specificaties in 1.2) met paraffine olie en monteer deze op de injector pomp plaatsende capillaire tot de tweede ring (Figuur 2B). Verplaats de capillaire houder in de x, y en z-as tot het uiteinde van het capillair wordt op de bregma, de samenhang punt tussen de sagittale en laterale hechtingen (figuur 2C) (te bepalen met behulp van een stereomicroscoop), en re-set x, y en z 0. Verplaats de capillair met ± 1,6 mm in de medio-laterale as (x) en -1,9 mm in de anterior-posterior as (y) en markeer het bot met behulp van een chirurgische stift. Maak een gat van ca. 0,5 mm diameter op de schedel met een elektrische boor aandacht niet naar de hersenen beschadigen. Plaats een 5 ul druppel virussuspensie (een gedeelte) op een stuk parafilm in het oor bars en dompel het uiteinde van het capillair in de druppel. Suck ca. 3,5 ul van virale suspensie op met een nanoliter injector ingesteld op 55 nl / sec. Snel uitvoeren van deze stap als de druppel zal verdampen. Verplaats de capillaire om de site of injectie en verplaats deze naar beneden totdat de punt raakt het pial oppervlak. Stel de dorso-ventrale aswaarde (z) op 0. Op dit moment dringen het weefsel met de capillaire voor -1,9 mm en laat 1,5 ul virale suspensie met een snelheid van 4 nl / sec. Wacht 2-3 minuten tot het terugstromen van virale schorsing via de capillaire track te minimaliseren en de capillaire trekken. Een tweede injectie kan worden uitgevoerd in de controlaterale halfrond. Hechten de huid te ontsmetten en het dier herstellen van anesthesie zoals eerder beschreven in utero elektroporatie (1,8). Figuur 2. Stereotaxische virale injectie. (A en B) Schematische weergave van de componenten om stereotactische injectie (A) en een gedemonteerde capillaire houder die het inbrengen van een ca voerenpillary tot de tweede ring (B). (C) Foto van de muis hoofd geïmmobiliseerd door het oor bars en gehemelte ondersteuning met de huid gesneden om de schedel (links) bloot te leggen. De vergroting van het gestippelde vak (rechts) toont de laterale en sagittale hechtingen, de bregma, en de injectieplaats (cirkel). 3. Behandeling van het monster Een tot drie weken na infectie, perfuseren de muis met ca. 100 ml van 4% PFA, ontleden van de hersenen en post-fix het 's nachts in 4% PFA. Uiteindelijk kan BrdU en / of tamoxifen worden toegediend vóór opoffering volgens verschillende paradigma celcycluskinetiek onderzoeken en de expressie van de virale transgenen geflankeerd door loxP plaatsen stoppen, respectievelijk 9. De hersenen kunnen worden verwerkt voor immunokleuring met meerdere markers van stamcellen en voorlopercellen cellen en neuronen (bijvoorbeeld SOX2, GFAP, Nestin, tbr2, doublecortin, etc).