Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em> In Utero</em> Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion
Summary
Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.
Abstract
Somatischen Stammzellen sich teilen, um weitere Stammzellen (Expansion) oder mehr differenzierte Zelltypen (Differenzierung), die von grundlegender Bedeutung für das Tissue Formation während der embryonalen Entwicklung und Gewebshomöostase im Erwachsenenalter 1 ist zu generieren. Derzeit werden große Anstrengungen zur Steuerung des Schalters von somatischen Stammzellen von der Expansion zur Differenzierung, da diese wird angenommen, dass von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien für die regenerative Medizin 1,2 investiert. Allerdings ist eine große Herausforderung in der Studie und die Verwendung von somatischen Stammzellen, dass ihre Expansion hat sich als sehr schwer zu kontrollieren.
Hier beschreiben wir ein System, das die Steuerung der neuralen Stamm / Vorläuferzelle (insgesamt als NSC bezeichnet) Expansion in der embryonalen Maus Kortex oder des Hippokampus Erwachsenen durch Manipulation der die Expression des cdk4/cyclinD1 Komplex, ein wichtiger Regulator der G1-Phase ermöglicht des Zellzyklus und somatischen Stammzellen differentiation 3,4. Insbesondere werden zwei unterschiedliche Ansätze beschrieben, mit dem die cdk4/cyclinD1 Komplexes in NSR wird in vivo überexprimiert. Durch den ersten Ansatz wird Überexpression der Zellzyklus-Regulatoren durch Einspritzen Plasmiden für cdk4/cyclinD1 im Lumen des Maus Telencephalon gefolgt von Elektroporation in utero Sie um NSC des lateralen Kortex liefern somit Auslösen episomalen Expression der erhaltene Transgene 5-8. Durch den zweiten Ansatz werden hochkonzentrierte HIV-Viren abgeleiteten stereotaktisch im Gyrus dentatus des Hippocampus erwachsenen Maus injiziert, damit Auslösen konstitutive Expression der Zellzyklusregulatoren nach der Integration des Konstrukts in der viralen Genom der infizierten Zellen 9. Beide Ansätze, deren Grundlagen wurden bereits von anderen Video-Protokolle 10-14 beschrieben, wurden hier, um i optimiert) zu reduzieren Gewebeschäden, ii) target breite Abschnitte von sehr spezifischen Gehirn regions, iii) erzielen hohe Anzahlen von manipulierten Zellen innerhalb jeder Region, und iv) auszulösen hohe Expressionsniveaus der Transgene in jeder Zelle. Transiente Überexpression der Transgene mit den beiden Ansätzen mit unterschiedlichen Mitteln durch natürliche Verdünnung der elektroporierten Plasmide durch Zellteilung oder Tamoxifen Verwaltung in Cre-exprimierenden NSC mit Viren Durchführung cdk4/cyclinD1 von loxP-Stellen flankiert infiziert bzw. 9,15 dh erhalten .
Diese Methoden stellen eine sehr leistungsfähige Plattform, um akut und Gewebe gezielt manipulieren die Expression von jedem Gen im Gehirn der Maus. Insbesondere durch die Manipulation der die Expression des Komplexes cdk4/cyclinD1 ermöglicht unser System die zeitliche Steuerung der Expansion NSC und deren Schalter auf Differenzierung, damit letztlich eine Erhöhung der Anzahl von Neuronen im Gehirn von Säugern erzeugt wird. Unser Ansatz kann von entscheidender Bedeutung für die Grundlagenforschung und die Verwendung somatischer Stammzellen für die Therapiedes zentralen Nervensystem von Säugetieren und gleichzeitig ein besseres Verständnis der i) Stammzellen Beitrag zur Gewebebildung während der Entwicklung, ii) Gewebshomöostase im Erwachsenenalter, iii) die Rolle der adulten Neurogenese in der kognitiven Funktionen, und vielleicht, iv) besser mit somatischen Stammzellen Zellen in Modellen von neurodegenerativen Erkrankungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein entscheidender Schritt in utero Elektroporation ist die Qualität und Reinheit der DNA seit seiner gerichtete Migration während der Lieferung der elektrischen Felder hängt seine Ladung. Protokolle für DNA-Reinigung, die keine Entfernung der zusätzlichen geladenen Molekülen wie Endotoxinen, kann auf die Maskierung der natürlichen DNA negativen Ladungen was zu schlechter Lieferung führen. Klar ist, dass die Berührung der Uteruswand mit den Elektroden möglichst nahe zu dem Bereich gezielt zu verbessern Elektroporationseffizienz. Ebenso wichtig ist die Qualität der verwendeten Elektroden, da dies grundlegend für die Lieferung der optimale elektrische Felder. Mikrokratzer nicht sogar mit bloßem Auge sichtbar und / oder organische Reste, wie Spuren von Serum, Lipide, und so weiter, wird unweigerlich Laufe der Zeit ansammeln, was zu Elektroden verliert ihre Eigenschaften. Alt und / oder verschmutzte electropes sind die wahrscheinlichste Ursache für einen plötzlichen Abfall bei der Elektroporation Effizienz und damit sollte r seineplaced sobald dies bemerkt wird. Während relativ einfach, in utero Elektroporation erfordert in der Regel ein paar Wochen Training, um zufrieden und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Diese Technik ist sehr vielseitig, da sie angewendet, praktisch ist, um alle Organe und Gewebe des sich entwickelnden Embryos. Sicherlich sind Organe enthält einen Hohlraum, wie Gehirn, besonders einfach zu richten und damit für einen hohen Anteil an transfizierten Zellen auf Grund der Leichtigkeit des Einspritzens ein relativ großes Volumen von DNA.
Ein häufiges Problem bei der Einrichtung stereotaxischen viralen Injektion auftritt, ist auf wenige infizierte Zellen und / oder zu einer unerwünschten Bereichen auszurichten. Das erste Problem wird hauptsächlich mit der Injektion von niedrigem Titer Viren korreliert. 293T-Zellen mit geringeren Zahl von Passagen in Kultur wachsen schneller und führen zu höheren Virustiter. Verwendung von Zellen älter als ca. 20 Passagen wird nicht empfohlen, und Mittel der Transfektion mit weniger als 80% Wirkungsgrad nicht gewährleisten eine gutevirale Produktion. Resuspension des viralen Pellet ist auch kritisch, hat die virale Suspension homogen und virale Klumpen, verschließen die Kapillare müssen vermieden werden könnte erscheinen. Viren sind sehr temperaturempfindlich Tropfen und Langzeitlagerung. Aus diesen Gründen müssen Aliquots dauerhaft bei -80 ° C gelagert werden und kann nicht wieder eingefroren werden. Auch unter diesen Bedingungen konnte eine Abnahme der Infektivität nach 6-12 Monaten Lagerung beachtet werden. In den Lernphasen, empfehlen wir, um das virale Titer von jedem Viruspräparats zu testen und es wieder tun nach längerer Lagerung. Die Anwesenheit von infizierten Zellen in unerwünschte Bereiche des Gehirns auf eine suboptimale Positionierung der Maus Kopf auf der stereotaktischen Rahmen, die einige Übung erfordert abhängen. Darüber hinaus ist es wichtig, nicht die Oberfläche des Gehirns beschädigen beim Öffnen der Öffnung an der Schädelbasis, weil sonst wird es nicht möglich sein, die 0 setzen korrekt auf der Pia-Oberfläche, was zu einer ungenauen Injektion. Die Koordinatendass wir in diesem Protokoll vorgesehen sind, um C57/BL6 6-10 Wochen alte Weibchen bezeichnet, und wir empfehlen sie bis zur anderen Stamm / Alter / Geschlecht. Erwerb dieser Technik kann mehr Zeit erfordern als in utero Elektroporation aufgrund der längeren Phasen benötigt, um die Viren vorbereitet und die Proben analysieren. Wir empfehlen dringend, dass Viren nur verwendet werden, nachdem der Maus Operation und stereotaktische Injektion geworden zuverlässig und reproduzierbar. Der erste Schritt, um dies zu erreichen ist es, Zell-permeierenden DNA Farbstoffe, wie Hoechst 33342, in Mäuse euthanasiert injizieren und analysieren die Gehirne sofort.
In utero Elektroporation und stereotaktische viralen Injektion sind zwei leistungsstarke Systeme akut und Gewebe gezielt manipulieren Genexpression im ZNS während der Entwicklung von Säugetieren und Erwachsenenalter. Trotz ihrer Begrenzung Targeting nur eine Subpopulation von Zellen, bieten diese Systeme eine beispiellose Geschwindigkeit und Leichtigkeit zu herkömmlichen Methoden verglichen, in insbesondere die umständliche und zeitraubende Generierung von transgenen Mäusen. Doch trotz dieser Ähnlichkeit gibt einige Unterschiede zwischen den beiden Techniken, die erwähnenswert sind. Zuerst in Bezug auf die Ausrichtung der verschiedenen Zelltypen, die in utero Elektroporation führt zunächst zu der Transfektion von Stammzellen ordnungsgemäßen (auch als radiale Gliazellen), weil dies die einzigen Zellen begrenzenden Ventrikels wo die DNA eingespritzt werden. Als Ergebnis der Zellteilungen, wird anschließend von Plasmiden gezielte, Mutter Stammzellen ihre Vorläuferzellen und / oder neuronalen Tochterzellen, die zur Umverteilung der transfizierten Zellen in der Kortex als eine Funktion der Zeit geerbt werden. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung von HIV Lentiviren im erwachsenen Gehirn auf die gleichzeitige Infektion von jedem Zelltyp wie Stammzellen, Vorläuferzellen Neuronen sowie reifen Gliazellen. Zu beachten ist, im Hinblick auf die Verwendung von HIV Lentiviren zu häufiger verwendeten Retroviren gegenüberliegenden ist die Tatsache, dass lentivirale Integration würde unabhängig von der mitotischen Zustand der Zellen auftreten, so dass die Targeting auch Erwachsene, ruhenden Stammzellen.
Zweitens ist ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen Elektroporation und viralen Infektion, die eine vorübergehende, episomale Expression des früheren erreicht wird, wie zum irreversiblen Integration der DNA in das Genom der infizierten Zellen durch das letztere erreicht entgegengesetzt. Als Ergebnis der aufeinanderfolgenden Zellteilungen Verdünnung der elektroporierten Plasmiden und Abbau des ektopischen CyclinD1 Protein würde an jedem Zellzyklus eintreten. So wurde Ausbau des NSC während der Embryonalentwicklung nur zuletzt für etwa zwei Tage 15 gezeigt, während im erwachsenen Gehirn dieser Effekt wurde festgestellt, dass für mehrere Monate (unveröffentlichte Ergebnisse) dauert.
Drittens, da i cdk4/cyclinD1) hat eine stärkere Wirkung auf Zellen mit einer längeren G1 und ii) gebunden neuralen Vorläuferzellen während der Entwicklung eine längere Zellzyklusals Stammzellen, während das Gegenteil der im Erwachsenenalter wahr, wurden unsere beiden Manipulationen gefunden, um die Expansion, vor allem von neuralen Vorläuferzellen während der Entwicklung und Stammzellen im Erwachsenenalter auslösen. In jedem Fall eine Zunahme der Neuronen wurde von beiden Methoden erreicht.
Viertens viralen Injektion leicht durchgeführt, zuverlässig und reproduzierbar, in vielen unterschiedlichen Bereichen des erwachsenen Gehirn durch einfaches Ändern der stereotaktischen Koordinaten. Im Gegensatz dazu könnte Zielgenauigkeit bestimmter Regionen des zentralen Nervensystems, wie Hirnstamm, Hippokampus, oder Rückenmark durch Elektroporation in utero schwieriger sein, reproduzierbar zu erreichen. Darüber hinaus, während stereotaktische Injektion bei Mäusen jeden Alters durchgeführt werden kann, wird eine optimale Leistung des in utero Elektroporation von etwa E11 bis E16 begrenzt. Stufen vor E11 würde erfordern entweder den Einsatz eines Ultraschall-Backscatter-Mikroskop 18,19 oder eine ganze Embryo kulture-System 17,20.
Vor kurzem hat ein zunehmendes Interesse an grundlegenden zellbiologischen von somatischen Stammzellen gefördert worden, weil ihre Studie und Manipulation gedacht werden, um grundlegend zur Entwicklung neuartiger Zell-basierte regenerative Therapien. Insbesondere für die Überexpression von cdk4/cyclinD1 stellt unser Protokoll die Mittel, um vorübergehend erhöhen die Expansion von NSC in vivo (3B und C und 4B und C), um die Zahl der Neuronen im erwachsenen Gehirn generiert erhöhen. Wir glauben, dass diese Manipulation kann beispielsweise in einer Anzahl von unterschiedlichen Kontexten wichtig zum besseren Verständnis der Rolle der NSC der Entwicklung des Gehirns, der Evolution und Homöostase sowie ihr Beitrag zu kognitiven Funktion oder Erholung von neuronalen Degeneration oder Verletzung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Center for Regenerative Therapies, der Medizinischen Fakultät der TU Dresden und dem DFG-Sonderforschungsbereich SFB655 (Teilprojekt A20) unterstützt. BA wurde durch ein Stipendium der DIGS-BB-Programm, Dresden unterstützt. Wir danken Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie und Ravi Jagasia für wertvolle Ratschläge bei der Einrichtung in utero Elektroporation und stereotaktische viralen Injektion.
Materials
| Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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References
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