توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em> في الرحم</em> الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية
Summary
السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.
Abstract
Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.
Protocol
Representative Results
Discussion
A خطوة حاسمة لفي الرحم الصعق الكهربائي هو نوعية ونقاء DNA منذ الهجرة في الاتجاه أثناء الولادة من الحقول الكهربائية يعتمد على شحنتها. قد بروتوكولات لتنقية DNA التي لا تتضمن إزالة جزيئات مشحونة إضافية، مثل السموم الداخلية، تؤدي إلى إخفاء من التهم DNA الطبيعية السلبية التي تؤدي إلى تسليم الفقراء. ومن الواضح أن لمس الجدران الرحم مع الأقطاب الكهربائية في أقرب مكان ممكن إلى المنطقة لاستهداف تحسين الكفاءة الصعق الكهربائي. نفس القدر من الأهمية هو نوعية الأقطاب المستخدمة لأن هذا أمر أساسي لإيصال المجالات الكهربائية الأمثل. سوف الخدوش الصغيرة غير مرئية بالعين حتى و / أو مخلفات العضوية، مثل آثار مصل، والدهون، وهكذا دواليك، تتراكم حتما مع مرور الوقت مما يؤدي إلى فقدان أقطاب ممتلكاتهم. electropes القديمة و / أو القذرة هي السبب الأكثر احتمالا لانخفاض مفاجئ في الكفاءة والصعق الكهربائي، وبالتالي، يجب أن تكون صeplaced بمجرد لاحظت هذا. في حين بسيطة نسبيا، في الصعق الكهربائي الرحم وعادة ما يتطلب بضعة أسابيع من التدريب من أجل تحقيق نتائج مرضية واستنساخه. هذه التقنية متعددة جدا حيث يمكن تطبيقه، تقريبا، إلى أي جهاز وأنسجة الجنين النامية. بالتأكيد، أجهزة تحتوي على تجويف، مثل الدماغ وتكون سهلة خصوصا لاستهداف والسماح لنسبة عالية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل نظرا لسهولة حقن كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي.
وهناك مشكلة مشتركة تواجه في إعداد حقن الفيروسية التجسيمي هو أن تكون الخلايا المصابة قليل و / أو لاستهداف مناطق غير مرغوب فيها. ويرتبط أساسا المشكلة الأولى مع حقن منخفضة عيار الفيروسات. الخلايا 293T مع انخفاض عدد من الممرات في الثقافة تنمو بشكل أسرع ويؤدي إلى ارتفاع التتر الفيروسية. باستخدام الخلايا أقدم من كاليفورنيا. سوف لا يوصى ب 20 الممرات وسائل ترنسفكأيشن بكفاءة أقل من 80٪ لا ضمان حسنالفيروسية الإنتاج. إعادة تعليق بيليه الفيروسية من الأهمية بمكان أيضا، وتعليق الفيروسية أن تظهر كتل متجانسة والفيروسية التي يمكن أن تسد الشعيرات الدموية يتعين تجنبها. الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة تنخفض والتخزين على المدى الطويل. لهذا الأسباب، مأخوذة تحتاج إلى تخزينها بشكل دائم في C ° -80 ولا يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. حتى في ظل هذه الظروف، يمكن أن يلاحظ انخفاض في الإصابة بعد 6-12 شهرا من التخزين. في مراحل التعلم، فإننا نقترح لاختبار عيار الفيروسية من كل الفيروسية وإعداد للقيام بذلك مرة أخرى بعد التخزين على المدى الطويل. يمكن وجود خلايا المصابة في مناطق غير مرغوب فيها من الدماغ يعتمد على تحديد المواقع دون المستوى الأمثل من رئيس الماوس على الإطار التجسيمي، الأمر الذي يتطلب بعض الممارسة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان عدم الاضرار سطح الدماغ أثناء فتح ثقب في الجمجمة بسبب وإلا فإنه لن يكون من الممكن إعادة تعيين ال 0 بشكل صحيح على سطح حنوني، مما أدى إلى حقن غير دقيقة. الإحداثياتأننا المنصوص عليها في هذا البروتوكول ويشار إلى C57/BL6 الإناث 6-10 أسابيع من العمر ونقترح لهم لتحسين سلالة مختلفة / العمر / الجنس. قد اقتناء هذه التقنية تحتاج إلى مزيد من الوقت من الصعق الكهربائي في الرحم نظرا لأطول مراحل اللازمة لإعداد الفيروسات وتحليل العينات. ونحن نوصي بشدة أن تستخدم فقط بعد الجراحة الماوس الفيروسات وحقن التجسيمي أصبحت موثوقة وقابلة للتكرار. الخطوة الأولى لتحقيق ذلك هي لحقن الأصباغ DNA الخلية نفيذ، مثل هويشت 33342، الموت الرحيم في الفئران وتحليل العقول على الفور.
في الصعق الكهربائي والحقن داخل الرحم الفيروسية التجسيمي هما نظم قوية لحاد والأنسجة تحديدا التلاعب التعبير الجيني داخل الجهاز العصبي المركزي خلال التنمية الثدييات والبلوغ. رغم القيد في استهداف جزء من السكان فقط من الخلايا، وهذه النظم توفر سرعة وسهولة غير مسبوقة بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، طن سيما الجيل شاقة وتستغرق وقتا طويلا من الفئران المعدلة وراثيا. لكن على الرغم من هذا التشابه والاختلافات القائمة بين العديد من الطريقتين التي يستحق الذكر. أولا، فيما يتعلق استهداف أنواع مختلفة من الخلايا، في الصعق الكهربائي يؤدي في البداية الرحم إلى ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية السليمة (وتسمى أيضا خلايا الدبقية شعاعي) لأن هذه هي الخلايا الوحيدة ترسيم البطين حيث يتم حقن الحمض النووي. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية، وسوف يتم في وقت لاحق البلازميدات الموروثة من المستهدف، والخلايا الجذعية الأم إلى السلف و / أو الخلايا العصبية مما يؤدي إلى ابنة إعادة توزيع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في جميع أنحاء القشرة بوصفها وظيفة من الزمن. في المقابل، فإن استخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في الدماغ البالغ يؤدي إلى عدوى متزامنة في أي نوع من الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية، الأسلاف، وكذلك الخلايا العصبية الخلايا الدبقية الناضجة. من المذكرة، فيما يتعلق باستخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في مقابل الفيروسات القهقرية أكثر شيوعا هو حقيقةوأن التكامل lentiviral تحدث بشكل مستقل عن الدولة الإنقسامية من الخلايا، مما يسمح للاستهداف أيضا، البالغ الخلايا الجذعية هادئة.
الثانية، وثمة فرق آخر هام بين الصعق الكهربائي والعدوى الفيروسية هو أن يتم التوصل إلى عابرة، التعبير episomal من السابق بدلا من دمج لا رجعة فيه DNA في الجينوم من الخلايا المصابة التي حققها هذا الأخير. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية على التوالي، التخفيف من البلازميدات electroporated، وتدهور البروتين cyclinD1 خارج الرحم، سوف تترتب على ذلك في كل دورة الخلية. وهكذا، ظهر توسيع مجلس الأمن القومي أثناء التطور الجنيني إلى الماضي فقط لما يقرب من 15 يوما بينما في الدماغ الكبار وجد هذا التأثير يستمر لعدة أشهر (نتائج غير منشورة).
الثالث، حيث ط) cdk4/cyclinD1 له تأثير أقوى على الخلايا مع أطول G1 والثاني) الأسلاف العصبية التي ارتكبت خلال التنمية لديها دورة الخلية تعدمن الخلايا الجذعية في حين أن العكس صحيح تماما خلال مرحلة البلوغ، تم العثور على بلدينا التلاعب لتحريك التوسع، في المقام الأول، من خلال الخلايا العصبية الأسلاف والتنمية الجذعية خلال مرحلة البلوغ. في كلتا الحالتين تم تحقيقه زيادة في الخلايا العصبية من قبل كل من الأساليب.
يمكنك بسهولة الرابعة، وحقن الفيروسية أن يؤديها، وبتكاثر موثوق، في مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ببساطة عن طريق تغيير إحداثيات التجسيمي. في المقابل، قد الاستهداف الدقيق لمناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي، مثل جذع الدماغ، وتشكيل قرن آمون، أو الحبل الشوكي، عن طريق الصعق الكهربائي داخل الرحم يكون أكثر صعوبة لتحقيق بتكاثر. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن إجراء الحقن التجسيمي على الفئران في أي عمر، ويقتصر الأداء الأمثل للفي الرحم الصعق الكهربائي من نحو E11 E16 ل. وقبل مراحل E11 يتطلب من استخدام الموجات فوق الصوتية المجهر تشتت ارتدادي 18،19 أو طائفة بأكملها الجنينلدى عودتهم نظام 17،20.
في الآونة الأخيرة، وقد تم الترويج اهتماما متزايدا في بيولوجيا الخلية الأساسية للخلايا الجذعية الجسدية بسبب ويعتقد دراستهم والتلاعب الأساسية لتكون الخلية رواية نحو تطوير العلاجات المستندة التجدد. ولا سيما بالنسبة للoverexpression من cdk4/cyclinD1، والبروتوكول يوفر وسيلة لدينا لزيادة transitorily توسيع مجلس الأمن القومي في الجسم الحي (الشكل 3B و 4B وC و C) من أجل زيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الكبار. ونحن نعتقد أن هذه قد تكون مهمة التلاعب في عدد من السياقات المختلفة لفهم أفضل لدور مجلس الأمن القومي في تطور الدماغ والتنمية والتوازن وكذلك مساهمتها في الوظيفة الإدراكية أو الشفاء من الضمور العصبي أو الإصابة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مركز العلاج التجديدي، وكلية الطب في دريسدن TU، ومركز البحوث التعاونية DFG SFB655 (A20 الفرعي). وأيد من قبل BA زمالة من برنامج الحفريات-BB، دريسدن. نشكر الدكاترة. نوريكو Osumi، نومورا تاداشي، ديتر كذبة Chichung، ورافي Jagasia للحصول على المشورة الثمينة خلال إنشاء الصعق الكهربائي في الرحم والحقن الفيروسية التجسيمي.
Materials
| Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain–using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
