Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em> In Utero</em> Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Nota preliminare La chirurgia deve essere eseguita da investigatori pienamente addestrati, previa autorizzazione da parte delle autorità locali per il benessere degli animali. Tutte le precauzioni devono essere adottate per ridurre al minimo il dolore e lo stress inflitto agli animali tra cui anestesia profonda, la somministrazione di analgesia postoperatoria e, per operazioni di durata superiore a 10 minuti, l'applicazione di un lubrificante occhio per prevenire la disidratazione della cornea e cecità. Topi anestetizzati deve essere mantenuto costantemente caldo a 37 ° C fino a completa guarigione e ogni strumento chirurgico e la soluzione deve essere sterile. Sebbene l'uso di una cappa biologica non è strettamente necessario, l'operatore deve prendere tutte le precauzioni ragionevoli per ridurre al minimo la possibilità di infettare l'animale durante l'operazione indossando un camice da laboratorio, maschera e guanti. Allo stesso modo, ogni passo riguardante la generazione e l'utilizzo di virus deve essere autorizzato e deve avvenire in zone S2 secondo le disposizioni delle autorità locali.Infine, una decontaminazione completa di tutti gli strumenti e le superfici che potrebbero essere stati a contatto con i virus devono essere eseguite in conformità alle pratiche approvati per gli impianti di disinfezione (per l'HIV pulendo con il 70% Et-OH e / o autoclave). Parte 1: Ampliamento della NSC embrionali 1. Elettroporazione in utero Dopo la clonazione (cioè i transgeni cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) o pDSV-mRFPnls vettori 16, purificare i plasmidi EndoFree usando kit e risospendere in PBS sterile a una concentrazione di 3-5 mg / mL. Poco prima dell'intervento chirurgico, miscelare i plasmidi con 0,05% in PBS FastGreen un rapporto finale di ca. 04:04:01 e centrifugare la miscela per 2 minuti a 16.000 xg per rimuovere tutti precipitati. Caricare la miscela DNA in un bicchiere precedentemente tirato borosilicato capillare. Tirare i parametri con un P-97 estrattore pipetta sono: tiro: 200; vel: 140, tempo: 140. Calore è dato da un test rampa e dipende dalla specsacco ific dei capillari in uso. Montare il capillare sul beccuccio del PicoPump che è vicino alla piattaforma di elettroporazione in utero (Figura 1A) e, sotto uno stereomicroscopio, piegare la punta e nick in corrispondenza del punto di flesso. Sterilizzare tutti gli strumenti di chirurgia in uno sterilizzatore a secco perle di vetro e profondamente anestetizzare un topo in stato di gravidanza al giorno 12-15 di gestazione con un vaporizzatore isoflurano. Posizionare l'animale in posizione supina su una piattaforma di riscaldamento a 37 ° C e mantenere sotto costante somministrazione isoflurano attraverso un cono. Rasatura la pelle dell'addome, disinfettare con tempi più Betaisodona, eventualmente pulire tra con etanolo 70%, e iniettare buprenorfina (diluito in PBS) per via sottocutanea a 0,1 mg / kg concentrazione preventiva analgesico. Usando forbici sottili, effettuare un taglio longitudinale 2 centimetri della pelle e, successivamente, della parete muscolare sottostante per accedere alla cavità peritoneale. Dispensare in ca cavità peritoneale. 2ml di soluzione IUE (D-PBS contenente 100 U / ml di pen / strep) preriscaldato a 37 ° C e mantenere la soluzione su una piastra riscaldante. Coprire il mouse con drap sterile contenente una fessura dalla quale cervice verrà rimosso. Ritrarre l'incisione con un divaricatore di tungsteno, identificare l'utero ed estrarlo tenendolo con una pinza tra embrioni adiacenti (Figura 1B, a sinistra) e infine si sdraiò sul drap sterile. Durante l'intera operazione, risciacquare l'utero con soluzione IUE per idratare la cavità organo e corpo e prevenire la disidratazione dell'animale. Maneggiare con cura l'utero tenendolo tra il pollice e l'indice e ruotare un embrione fino alla sua testa è visibile e orientata verso l'operatore. Identificare gli emisferi telencefalici e iniettare uno di loro dal dorso-laterale. Rilasciare 1-2 microlitri della soluzione di DNA usando il pedale di un PicoPump finché il ventricolo viene delineato da FastGreen (Figura 1B, destra). <li> Inserire l'anodo degli elettrodi sul sito di iniezione e il catodo sul lato controlaterale (Figura 1C) e fornire 6 impulsi di 30 V per 50 ms con intervallo di 950 ms tra ogni impulso utilizzando un elettroporatore generare campi elettrici di forma quadrata azionato attraverso un interruttore a pedale. Evitare di posizionare gli elettrodi vicino alla placenta in quanto ciò potrebbe causare emorragie e danni l'embrione. Quando tutti gli embrioni vengono iniettati e elettroporate, posizionare l'utero indietro nella cavità addominale e chiudere le pareti muscolari con un filo di sutura sutura ogni 3-4 mm. I nodi deve essere aderente al muscolo, ma non troppo stretto per consentire un po 'di gonfiore dei tessuti. Infine, chiudere la pelle sovrastante con clip metalliche. Disinfettare la pelle con Betaisodona, togliere il mouse dalla maschera isoflurano e trasformare in una gabbia di alloggiamento quando è completamente sveglio. Monitorare il recupero del mouse fino comportamento locomotorio è normale. 2. Elaborazione del samPLE Uno o più giorni dopo l'elettroporazione, sacrificare il mouse, raccogliere gli embrioni e di individuare quelli correttamente elettroporate utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 1D). Staccare il cervello su ghiaccio-freddo PBS, e fissare per una notte in 4% PFA (paraformaldeide in tampone fosfato pH 7,4). Alla fine, BrdU può essere somministrato prima del sacrificio secondo paradigmi diversi per indagare cinetica del ciclo cellulare e la proliferazione cellulare 3. I cervelli vengono poi elaborati per il sezionamento e immunostaining per i marcatori diversi glia radiale, progenitori basali e neuroni (Pax6, Nestin, tbr2, Tbr1, Tuj1 ecc) per valutare l'effetto dei transgeni funzionali su mirato NSC e la loro progenie che sono identificato l'espressione del co-elettroporata gene reporter. Figura 1.In elettroporazione utero. (A) Rappresentazione schematica di una piattaforma di elettroporazione in utero. (B) disegni che illustrano il posizionamento del mouse incinta durante l'intervento chirurgico (a destra) e l'iniezione del DNA / FastGreen miscela (blu) nell'emisfero telencephalic di un embrione di topo (a sinistra). (C) Schema che mostra il posizionamento degli elettrodi a contatto con le pareti uterine con l'anodo (+) adiacente al sito di iniezione (blu). Le frecce indicano la migrazione del DNA verso l'anodo. (D) Foto di un mouse embrione 24 ore dopo l'elettroporazione con plasmidi GFP al giorno embrionale 13. La linea tratteggiata delimita l'emisfero telencephalic. Schema in A modificato da Calegari et al., 2004 17. Parte 2: Ampliamento della Adult NSC 1. Produzione di HIV-derivati ​​particelle virali Giorno 1: piastra 5 x 10 6 cellule 293T su un cm 10piatto con 8 ml di D-MEM contenente il 10% del calore di siero fetale bovino inattivato e 100 U / ml di pen / strep (terreno di coltura). Utilizzare 15 piatti per una preparazione virale e cultura overnight a 37 ° C, 5% di CO 2. Giorno 2: per ogni piatto, diluire in 1 ml di pianura D-MEM 5 mg di ciascuno dei 3 plasmidi codifica per i) VSVG (tipo virus della stomatite vescicolare G) proteina dell'involucro, ii) gag / pol (antigene specifico gruppo / polimerasi) e iii) un costrutto policistronico esprimere i transgeni funzionali e reporter (cioè cdk4/cyclinD1/GFP) precedentemente clonati in un vettore di HIV-based trasferimento (p6NST90) 9. Mescolare questa soluzione con 1 ml di D-MEM contenente 45 microlitri di polietilenimmina che è stato preventivamente sciolto in PBS a 1 mg / ml di soluzione concentrata, ed incubare per 15-30 min a temperatura ambiente. Nel frattempo, rimuovere il supporto dalle cellule e aggiungere 4 ml per piastra di fresco D-MEM contenente il 15% del calore di siero fetale bovino inattivato e 100 U / ml di pen / strep. Aggiungere il 2 ml di miscela di trasfezione e pernottamento cultura. Giorno 3: aggiungere 120 ml di 500 mM Na-butirrato a piatto per migliorare l'espressione dei transgeni, mescolare delicatamente e cultura per 6-8 ore dopo che sostituiscono il mezzo trasfezione con 5 ml di terreno di coltura. 4 ° giorno: Raccogliere i surnatanti (ca. 70 ml totale), passare attraverso un filtro 0,22 micron e il trasferimento in provette per centrifuga polyallomer 2 (35 x 89 mm). Ultracentrifuga a 110.000 xg per 90 min a 4 ° C utilizzando un rotore swing. Eliminare il supernatante, aggiungere 6 ml di PBS in ogni provetta e incubare in ghiaccio per 1 ora. Risospendere il pellet e trasferirlo in una provetta da centrifuga polyallomer (14 x 95 mm). Ultracentrifuga a 110.000 xg per 90 min a 4 ° C utilizzando un rotore swing. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di PBS, fare 5 pl aliquote e conservare a -80 ° C. Titolo virale sarà nell'intervallo di 10 8 -10 9 cfu / ml. (Nota: i virus sono molto sensibili alla temperatura e stoccaggio, AVOid ri-congelamento, tenere in ghiaccio secco durante il trasporto e scongelare poco prima dell'uso.) 2. Iniezione stereotassica Anestetizzare un topo 6-10 settimane con isoflurano e posizionare l'animale in posizione prona su un telaio stereotassico (Figura 2A) utilizzando le barre orecchio e il palato supporto per fissare correttamente la testa. L'animale viene mantenuto caldo su un rilievo di riscaldamento a 37 ° C e sotto costante somministrazione isoflurano. Iniettare per via sottocutanea 100 pl di soluzione di buprenorfina lavorare come preventivo analgesico, barba una striscia di pelle sulla testa del mouse e disinfettare come descritto in 1.4. Usando un bisturi, fare un ca. 1,5 cm di lunghezza incisione longitudinale sulla pelle testa esporre il cranio a livello della sutura sagittale. Ritrarre la pelle e pulire delicatamente la superficie ossea, con un batuffolo di cotone sterile. Riempire a metà un capillare di vetro (specifiche 1.2) con olio di paraffina e montarlo sulla pompa iniettore inserimentoil capillare fino al secondo anello (Figura 2B). Spostare il supporto capillare sull'asse x, yez finché la punta del capillare è posizionato sul bregma, il punto di congiunzione tra le suture sagittale e laterale (Figura 2C) (da definire con l'ausilio di uno stereomicroscopio), e re-set x, y, z ed i valori a 0. Spostare il capillare da ± 1,6 mm in asse medio-laterale (x) e -1,9 mm nel asse anteriore-posteriore (y) e contrassegnare l'osso con una penna marcatore chirurgico. Praticare un foro di ca. 0,5 mm di diametro sul cranio con un trapano elettrico facendo attenzione a non danneggiare il cervello. Mettere a goccia 5 ml di sospensione virale (1 aliquota) su un pezzo di parafilm posizionato sulle barre orecchio ed immergere la punta del capillare nella gocciolina. Succhiare ca. 3,5 ml di sospensione virale utilizza un iniettore nanolitri fissato a 55 nl / sec. Eseguire questo passaggio rapidamente la goccia evapora. Spostare il capillare al sito of iniezione e spostarlo verso il basso fino a quando la punta tocca la superficie piale. Resettare il dorso-ventrale valore asse (z) a 0. A questo punto, penetrano il tessuto con il capillare per -1,9 mm e rilasciare 1,5 ml di sospensione virale ad una velocità di 4 nl / sec. Attendere per 2-3 minuti per minimizzare il riflusso di sospensione virale attraverso la pista capillare e quindi ritrarre il capillare. Una seconda iniezione può essere eseguita nell'emisfero controlaterale. Suturare la pelle, disinfettare, e permettere all'animale di recuperare da anestesia, come descritto in precedenza per elettroporazione in utero (1.8). Figura 2. Stereotassico iniezione virale. (A e B) Rappresentazione schematica dei componenti necessari per eseguire l'iniezione stereotassica (A) e un supporto smontato capillare che mostra l'inserimento di un capillary fino al secondo anello (B). (C) Foto di testa di topo immobilizzato dalle barre orecchio e il sostegno palato con la pelle tagliata per esporre il cranio (a sinistra). L'ingrandimento della scatola tratteggiata (destra) mostra le suture laterali e sagittale, il bregma, e il sito di iniezione (cerchio). 3. Trattamento del campione One-to-tre settimane dopo l'infezione, perfusione il mouse con ca. 100 ml del 4% PFA, sezionare il cervello e post-fix durante la notte nel 4% PFA. Alla fine, BrdU e / o tamoxifen può essere somministrata prima del sacrificio secondo paradigmi diversi per indagare cinetica del ciclo cellulare e per arrestare l'espressione dei transgeni virali fiancheggiati da siti loxP, rispettivamente, 9. Il cervello può quindi essere trattati per immunoistochimica utilizzando numerosi marcatori di cellule staminali e progenitori e neuroni (ad esempio, Sox2, GFAP, Nestin, tbr2, doublecortin, ecc.)