によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em>子宮内</em>エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

予備的ノート手術は動物福祉のために地元当局から承認を受けて、完全に訓練された調査員が行う必要があります。すべての予防措置は、深い麻酔、術後鎮痛の投与と、10分以上持続する操作のため、角膜の脱水および失明を防ぐために、目の潤滑剤の適用を含めて動物に与えた痛みやストレスを最小限にするために注意しなければなりません。麻酔したマウスを37℃常に保温されている必要があり℃で完全回復し、すべての手術器具、溶液は無菌でなければならないまで。生物学的なフードの使用は厳密には必要ではありませんが、オペレータは、白衣、マスク、手袋を着用して、動作中の動物に感染する可能性を最小限に抑えるために、あらゆる適切な手段を講じる必要があります。同様に、ウイルスの生成および使用に関するすべてのステップは、承認されなければならず、地方自治体の条例に従って、S2領域で実行する必要があります。最後に、ウイルスと接触していた可能性のあるすべてのツールや面の徹底的な除染が承認された施設の消毒の慣行（HIVのための70％のEt-OH及び/又はオートクレーブで拭いて）に従って実施されなければならない。 パート1：胚NSCの拡張 （1） 子宮内エレクトロポレーションで クローニング後PCMS-EGFP（Clontech社製）またはpDSV-mRFPnlsベクトル16で導入遺伝子（ すなわち cdk4/cyclinD1）は、3-5μg/μLの濃度に滅菌PBSに再懸濁しEndoFreeキットを使用してプラスミドを精製する。すぐに手術する前に、CAの最終比でPBS中の0.05％FastGreenとプラスミドを混ぜる。 4時04分01秒、すべての沈殿物を除去するために16000×gで2分間混合物を遠心分離する。 以前に引っ張らホウケイ酸ガラスキャピラリーにDNA混合物をロードします。 P-97ピペットプラーを使って引っ張るパラメータは次のとおりです。プル：200; VEL：140;時間：140。熱はランプ試験によって与えられるとスペックに依存します毛細血管のIFIC多く使用されている。 子宮内エレクトロポレーション·プラットフォーム（ 図1A） に近いPicoPumpのノズルにキャピラリーをマウントし、実体顕微鏡下で、その先端と変曲点でのニックネームに曲げる。 乾燥したガラスビーズ滅菌器内のすべての手術ツールを殺菌し、深くイソフルラン気化器を使用して妊娠の日12月15日に妊娠マウスを麻酔。 37℃に設定した加熱·プラットフォーム上で仰臥位の動物を配置し、ノーズコーンを介して定イソフルラン管理下に保つ。 、腹部の皮膚を剃る最終的に70％エタノールで拭く間に、Betaisodona複数回に消毒し、先制鎮痛剤として0.1 mg / kgの濃度で皮下（PBSで希釈）ブプレノルフィンを注入します。腹膜腔にアクセスするために、微細なハサミを使用して皮膚の2cm縦カットをすると、その後、下にある筋肉の壁。腹腔カリフォルニア州免ずる。 2IUE液（D-PBSをペニシリン/ストレプトマイシンの100 U / mlを含む）のmlは37℃温め℃、加熱ブロックで解決策を保つ。 子宮が削除される割れ目を含む滅菌DRAPでマウスをカバーしています。タングステンリトラクタを使って切開を撤回し、子宮を識別し、隣接した胚の間に鉗子（ 図1B;左）とそれを保持し、それを引き出し、最終的に無菌DRAP上に横たわっていました。全体の動作時には、臓器や体腔に潤いを与えると動物の脱水を防ぐために、IUE液で子宮をすすいでください。 子宮は慎重に親指と人差し指の間にそれを保持するハンドルとヘッドが見えると演算子を志向されるまで、1つの胚を回します。終脳半球を識別し、背側面からそれらのいずれかを注入します。心室がFastGreen（;右図1B）によって概説されるまでPicoPumpのフットスイッチを使用してDNA溶液の1〜2μlを放します。 <li>を置き、注射部位に電極の陽極と反対側のカソード（ 図1C）、運営正方形状の電界を発生させるエレクトロポレーターを使用して、各パルスの間に950ミリ秒間隔で50ミリ秒間30Vの6パルスを供給フットスイッチを介して。これは出血とダメージ胚を引き起こす可能性があるため、電極が胎盤に近い配置することは避けてください。 すべての胚を注入し、エレクトロポレーションされた場合、腹腔内に戻って子宮を配置し、3〜4日毎mmを縫合縫合文字列を使用して筋肉の壁を閉じます。ノットは、組織の少し腫れを許すことができないくらい硬くなった筋肉にぴったりではなく、されるべきである。最後に、金属製のクリップを使用して覆っている皮膚を閉じます。 Betaisodonaで皮膚を消毒し、イソフルランマスクからマウスを削除して、完全に目を覚まし住宅ケージに移す。運動行動が正常になるまで、マウスの回復を監視します。 2。 SAMの処理PLE 一日以上のエレクトロポレーションした後、マウスを犠牲に胚を収集し、正しく蛍光実体顕微鏡（ 図1D）を使用して、エレクトロポレーション、それらを識別します。氷冷PBSで脳を解剖すると、4％PFA（リン酸緩衝液（pH7.4）でホルムアルデヒド）で一晩固定します。結局、BrdUは細胞周期動態および細胞増殖3を調査するために異なるパラダイムによると犠牲の前に投与することができる。 脳はその後である官能標的NSC上導入遺伝子およびその子孫の影響を評価するために、基礎前駆細胞およびニューロン（PAX6、ネスチン、Tbr2、Tbr1、Tuj1など）、放射状グリアのいくつかのマーカーのための切片と免疫染色のために処理される同時エレクトロレポーター遺伝子の発現により同定した。 図1。子宮内エレクトロポレーション·プラットフォームでの子宮内エレクトロポレーションで。（）模式図。 （B）は、手術時に妊娠したマウスの位置（右）とマウス胚（左）の終脳半球におけるDNA / FastGreen混合物（青）の注入を示す図面。 （C）はSchemeは注射部位（青色）に隣接する正極（+）と子宮の壁と接触する電極の配置を示す。矢印は陽極に向かってDNAの移動を示しています。胎生13日目のGFPプラスミドをエレクトロポレーション後のマウス胚24時間（D）の写真。破線は終脳半球境界が設定されます。 Calegari らから変更、2004 17のスキーム。 パート2：アダルトNSCの拡張 1。 HIV由来ウイルス粒子の産生 1日目：10 cmのプレート5×10 6個の 293T細胞D-MEMで熱不活性化ウシ胎児血清10％及びペニシリン/ストレプトマイシン（培地）の100 U / mlを含む8mlのと皿。 37℃で一晩1ウイルス調製および培養のための15皿℃、5％CO 2を使用します。 2日目：すべての料理のために、私のエンコード3プラスミドのそれぞれのプレーンのD-MEM5μgを1 mlに希釈）VSVG（水疱性口内炎ウイルスタイプG）エンベロープタンパク質、ⅱ）ギャグ/ POL（群特異抗原/ポリメラーゼ）と、iii）ポリシストロンは以前、HIVベースのトランスファーベクター（p6NST90）9にクローニングされた機能およびレポーター遺伝子（ すなわち cdk4/cyclinD1/GFP）を発現する構築。 D-MEMで1 mg / mlの原液でPBSにあらかじめ溶解し、室温で15〜30分間インキュベートされたポリエチレンイミンの45μlを含む1mlのこの溶液を混ぜて。一方、細胞から培地を除去し、熱不活性化ウシ胎児血清の15％、ペニシリン/ストレプトマイシンの100 U / mlを含む新鮮なD-MEMの皿あたり4 mlを加える。 2メートルを追加トランスフェクション混合物と文化を一晩のl。 3日目：導入遺伝子の発現を増強する皿当たりのNa-ブチレート500mMの120μlを添加し、培地5mlでトランスフェクション培地を交換した後、6〜8時間穏やかに、文化混ぜる。 4日目：上清を（約70ミリリットルの合計）を収集し、2ポリアロマーの遠心チューブ（35×89ミリメートル）で0.22μmのフィルターおよび転送を通過します。 °Cのスイングローターを用いて4℃で90分間、110,000 xgで遠心機。上清を捨て、各チューブにPBSの6ミリリットルを加え、1時間氷上でインキュベートする。ペレットを再懸濁し、1ポリアロマー遠心チューブ（14×95 mm）で、それを転送します。 °Cのスイングローターを用いて4℃で90分間、110,000 xgで遠心機。上清を捨て、PBS50μlにペレットを再懸濁し、-80℃で5μlを、店舗を作る℃にウイルス力価は10 8〜10 9 cfu / mlの範囲であろう。 （ 注：ウイルスは温度と貯蔵、AVOに非常に敏感であるIDの再凍結は、輸送中にドライアイス上に保持し、使用する前にすぐに解凍します。） 2。定位注入イソフルランで6-10週齢のマウスを麻酔し、適切に頭部を固定する耳バーや口蓋のサポートを使用して定位フレーム（ 図2A）に腹臥位に動物を配置します。動物は37℃と一定イソフルラン政権下で設定した加熱パッドの上に保温されています。 、皮下に先制鎮痛剤としてブプレノルフィンワーキング溶液100μlを注入し、マウスの頭の上に皮膚のストライプを剃る、1.4で説明したようにdesinfect。メスを使用して、CAを作る。矢状縫合のレベルで頭蓋骨を露出頭皮に1.5 cmの長い縦切開。皮膚を撤回し、優しく滅菌綿棒で骨表面を清掃してください。 パラフィン油でガラスキャピラリー（1.2仕様）ハーフ記入して挿入噴射ポンプにマウントセカンドリング（ 図2B）まで毛細血管。キャピラリーの先端はブレグマ、矢状縫合と横方向（ 図2C）間の連動ポイント（実体顕微鏡の助けを借りて決定される）に配置されるまでのx、y、z軸でキャピラリーホルダーを移動し、再集合x、y、zの値を0に設定します。 前後軸（y）に±メディオ – 横軸の1.6ミリメートル（x）および-1.9 mmのキャピラリーを移動して、外科的マーカーペンを用いて骨をマーク。 CAの穴をあけます。脳に損傷を与えないように注意を払って電動穴あけ機を使用して頭蓋骨に直径0.5mm。 耳バー上に配置パラフィルムの一部にウイルス懸濁液5μlの液滴（1アリコート）を入れて、液滴中の毛細血管の先端を飛び込む。 caを吸う。ナノリットル注入器を用いてウイルス懸濁液3.5μlを55 NL /秒で設定します。液滴が蒸発するにつれて急速にこのステップを実行します。 キャピラリはサイトoに移動F注射と先端が軟膜表面に触れるまでそれを下に移動。 0に背腹軸の値（Z）をリセットします。この時点で、-1.9ミリメートルのためのキャピラリーを用いて組織を貫通し、4 NL /秒の速度でウイルス懸濁液の1.5μlを離します。ウイルス懸濁液トラフキャピラリートラックの逆流を最小限に抑えるし、毛細血管を後退させるために2〜3分待ってください。二回目の注射はcontrolateral半球で行うことができます。 、皮膚を縫合消毒、および子宮内エレクトロポレーション（1.8）のために、前述したように、動物が麻酔から回復することができます。 図2。定位ウイルス注射。（AとB）の回路図定位注射（）を実行するために必要なコンポーネントの表現とCAの挿入を示す分解しキャピラリーホルダーセカンドリング（B）までpillary。 （C）は、皮膚と耳のバーや口蓋のサポートにより固定化マウスヘッドの写真は頭蓋骨（左）を公開するためにカットします。点線（右）の倍率は、横方向と矢状縫合を示しブレグマ、及び注射部位（丸）。 3。サンプルの処理ワン·トゥ·3週間、感染後、CAを使用してマウスを灌流する。 4％の100ミリリットルPFAは、脳を解剖し、4％PFAで一晩後固定してください。結局、BrdUと/またはタモキシフェンは、それぞれ9、細胞周期動態を調査し、loxP部位が隣接ウイルス導入遺伝子の発現を停止するために異なるパラダイムによると犠牲の前に投与することができる。 脳は、その後、幹細胞や前駆細胞と神経細胞（ 例えば、レトロウイルスベクター、GFAP、ネスチン、Tbr2、doublecortinなど）のいくつかのマーカーを用いた免疫染色のために処理することができます。