La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em> In Utero</em> La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Nota preliminar La cirugía debe ser realizada por investigadores entrenados completamente tras la aprobación de las autoridades locales para el bienestar animal. Todas las precauciones se deben tomar para minimizar el dolor y el estrés causado al animal, incluyendo anestesia profunda, la administración de analgesia postoperatoria y, para las operaciones que duran más de 10 minutos, la aplicación de un lubricante ocular para prevenir la deshidratación corneal y ceguera. Ratones anestesiados deben mantenerse constantemente caliente a 37 ° C hasta su recuperación completa y todas las herramientas quirúrgicas y la solución debe ser estéril. Aunque el uso de una campana biológica no es estrictamente necesario, el operador debe tomar todas las precauciones necesarias para reducir al mínimo la posibilidad de infectar al animal durante la operación con el uso de una bata, mascarilla y guantes. Del mismo modo, cada paso sobre la generación y el uso de virus debe ser autorizado y debe llevarse a cabo en áreas S2 de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales.Finalmente, una descontaminación completa de todas las herramientas y las superficies que podría haber estado en contacto con los virus deben ser realizados de acuerdo con las prácticas de las instalaciones aprobadas desinfección (para el VIH, limpiando con 70% Et-OH y / o esterilización en autoclave). Parte 1: Expansión de Embryonic NSC 1. En la electroporación in utero Después de la clonación de los transgenes (es decir cdk4/cyclinD1) en PCMS-EGFP (Clontech) o pDSV-mRFPnls vectores 16, purificar los plásmidos usando kit EndoFree y se resuspende en PBS estéril a una concentración de 3-5 g / l. Poco antes de la cirugía, se mezclan los plásmidos con 0,05% FastGreen en PBS a una relación final de ca. 04:04:01 y se centrifuga la mezcla durante 2 minutos a 16.000 xg para eliminar todo precipitados. Cargar la mezcla de ADN en un vaso previamente sacó borosilicato capilar. Tirando parámetros utilizando una pipeta P-97 Extractor son: extracción: 200; vel: 140; hora: 140. El calor es dada por un ensayo de la rampa y depende de la especificaciónmucho ific de capilares que se utiliza. Montar el capilar en la boquilla de la PicoPump que está cerca de la plataforma en la electroporación in utero (Figura 1A) y, bajo un microscopio estereoscópico, doblar su punta y nick en el punto de inflexión. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un vaso seco esterilizador de cuentas y profundamente anestesiar a un ratón embarazada en el día 12-15 de gestación utilizando un vaporizador de isoflurano. Colocar el animal en posición supina sobre una plataforma de calefacción a 37 ° C y mantener bajo administración isoflurano constante a través de un cono nasal. Afeitar la piel del abdomen, desinfectar con tiempos de Betaisodona múltiples, eventualmente limpiar entre en con 70% de etanol, y se inyecta la buprenorfina (diluido en PBS) por vía subcutánea a 0,1 mg / kg de concentración como preventivo analgésico. Usando unas tijeras finas, realizar un corte longitudinal de 2 cm de la piel y, posteriormente, de la pared subyacente muscular para acceder a la cavidad peritoneal. Vierta en la ca cavidad peritoneal. 2ml de solución de IUE (D-PBS que contenía 100 U / ml de penicilina / estreptomicina) precalentado a 37 ° C y mantener la solución en un bloque de calentamiento. Cubra el ratón con drap estéril que contiene una grieta de la que se retira el útero. Retirar la incisión con un retractor de tungsteno, identificar el útero y tire de ella sujetándola con pinzas entre embriones adyacentes (Figura 1B; izquierda) y, finalmente, se tendió en el drap estéril. Durante toda la operación, enjuagar el útero con solución de IUE para hidratar la cavidad de órganos y el cuerpo y prevenir la deshidratación del animal. Maneje con cuidado el útero lo sostiene entre los dedos pulgar e índice y gire un embrión hasta que su cabeza es visible y orientada hacia el operador. Identificar los hemisferios telencefálicas e inyectar uno de ellos desde el lado dorso-lateral. Liberar 1-2 l de la solución de ADN usando el interruptor de pie de un PicoPump hasta el ventrículo se describe por FastGreen (Figura 1B; derecha). <li> Colocar el ánodo de los electrodos en el sitio de la inyección y el cátodo en el lado contralateral (Figura 1C) y entregar 6 pulsos de 30 V durante 50 ms con 950 ms intervalo entre cada pulso usando un electroporador generar de forma cuadrada campos eléctricos de uso a través de un pedal. Evite colocar los electrodos cerca de la placenta, ya que puede causar hemorragias y daño al embrión. Cuando todos los embriones son inyectados y electroporación, colocar el útero en la cavidad abdominal y cerrar las paredes musculares con una cadena de sutura para suturar cada 3-4 mm. Los nudos debe ser ajustado para el músculo, pero no demasiado apretado para permitir una ligera hinchazón del tejido. Por último, cierre la piel que lo recubre con clips metálicos. Desinfecte la piel con Betaisodona, quitar el ratón de la máscara de isoflurano y la transfiere en una jaula de la vivienda cuando está completamente despierto. Controlar la recuperación del ratón hasta que el comportamiento locomotor es normal. 2. Tratamiento de la sample Uno o más días después de la electroporación, sacrifica el ratón, recoger los embriones e identificar aquellas correctamente electroporación utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Figura 1D). Diseccionar el cerebro en PBS enfriado en hielo, y fijar durante la noche en 4% PFA (paraformaldehído en tampón de fosfato pH 7,4). Eventualmente, BrdU se puede administrar antes de sacrificio de acuerdo a diferentes paradigmas para investigar la cinética del ciclo celular y la proliferación celular 3. Los cerebros se procesan entonces para seccionar y la inmunotinción para los varios marcadores de la glía radial, progenitoras basal y las neuronas (Pax6, nestina, Tbr2, Tbr1, Tuj1 etc) para evaluar el efecto de los transgenes funcionales en específica NSC y su progenie que son identificado por la expresión del gen indicador co-electroporada. Figura 1.En la electroporación in utero. (A) Representación esquemática de una plataforma en el útero de la electroporación. (B) los planos que muestran el posicionamiento del ratón embarazada durante la cirugía (a la derecha) y la inyección de la mezcla de ADN / FastGreen (azul) en el hemisferio telencephalic de un embrión de ratón (izquierda). (C) Esquema que muestra la colocación de los electrodos en contacto con las paredes del útero con el ánodo (+) adyacente al sitio de inyección (azul). Las flechas indican la migración del ADN hacia el ánodo. (D) Imagen de un embrión de ratón de 24 horas después de la electroporación con plásmidos GFP en el día embrionario 13. La línea de puntos delimita el hemisferio telencephalic. Esquema de una modificación de Calegari et al., 2004 17. Parte 2: Ampliación del Consejo de Seguridad Nacional de Adultos 1. Producción de derivados del VIH partículas virales Día 1: placa de 5 x 10 6 células 293T en una de 10 cmplato con 8 ml de D-MEM que contiene 10% de inactivado por calor suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina (medio de cultivo). Utilice 15 platos para una preparación viral y la cultura durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. Día 2: para cada plato, se diluye en 1 ml de D-MEM llano 5 g de cada uno de los 3 plásmidos que codifica para i) VSVG (tipo de virus de la estomatitis vesicular G) proteína de la envoltura, ii) gag / pol (antígeno específico de grupo / polimerasa) , y iii) un polycistronic construcción que expresa los transgenes funcionales y reportero (es decir cdk4/cyclinD1/GFP) previamente clonado en un vector de transferencia basado en VIH-(p6NST90) 9. Mezclar esta solución con 1 ml de D-MEM que contiene 45 l de polietilenimina que se ha disuelto previamente en PBS a 1 mg / ml de solución madre, y se incuba durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, eliminar los medios de comunicación de las células y añadir 4 ml por placa de D-MEM fresco que contiene 15% de inactivado por calor suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina. Añadir el m 2l de mezcla de transfección y cultivo durante la noche. Día 3: añadir 120 l de 500 mM Na-butirato por placa para mejorar la expresión de los transgenes, mezclar suavemente y cultura para 6-8 horas después de que reemplazar el medio de transfección con 5 ml de medio de cultivo. Día 4: recoger los sobrenadantes (ca. 70 ml en total), pasar a través de un filtro de 0,22 micras y transferencia en 2 tubos de centrífuga de polialómero (35 x 89 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. Desechar el sobrenadante, añadir 6 ml de PBS a cada tubo e incubar en hielo durante 1 hr. Resuspender el precipitado y transferirlo en un tubo de centrífuga de polialómero (14 x 95 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 50 l de PBS, hacer 5 ml de alícuotas y se almacena a -80 ° C. Título viral estará en el rango de 10 -10 8 9 ufc / ml. (Nota: los virus son muy sensibles a la temperatura y el almacenamiento avoIdentificación del re-congelación, mantener en hielo seco durante el transporte y descongelar poco antes de su uso.) 2. Inyección estereotáxica Anestesiar a un ratón 6-10 semanas de edad con isoflurano y colocar el animal en posición prona en un marco estereotáxico (Figura 2A) con las barras de soporte del oído y el paladar para fijar correctamente la cabeza. El animal se mantiene caliente en una almohadilla térmica a 37 ° C y bajo la administración de isoflurano constante. Inyectar por vía subcutánea 100 l de solución de trabajo buprenorfina como preventivo analgésico, afeitar una banda de piel de la cabeza del ratón, y desinfectar, como se describe en 1,4. El uso de un bisturí, hacer una ca. 1,5 cm de largo incisión longitudinal en la piel de la cabeza exponer el cráneo a nivel de la sutura sagital. Retirar la piel y limpie suavemente la superficie del hueso con un bastoncillo de algodón estéril. La mitad de llenar un vaso capilar (especificaciones de 1,2) con aceite de parafina y montarlo en la bomba de inyección de insertarel capilar hasta que el segundo anillo (Figura 2B). Mueva el soporte capilar en el eje x, y y z hasta que la punta del capilar se coloca en el bregma, el punto de conjunción entre las suturas sagital y lateral (figura 2C) (a ser determinado con la ayuda de un microscopio binocular), y re-conjunto x, y, y z valores a 0. Mueva el capilar por ± 1,6 mm en el eje medio-lateral (x) y -1,9 mm en el eje anterior-posterior (y) y marcar el hueso usando un lápiz marcador quirúrgico. Hacer un agujero de aprox. 0,5 mm de diámetro en el cráneo utilizando un perforador eléctrico teniendo cuidado de no dañar el cerebro. Poner una gotita de 5 l de suspensión viral (1 parte alícuota) en un trozo de Parafilm colocan en las barras del oído y sumergir la punta del capilar en la gotita. Suck ca. 3,5 l de suspensión viral usando un inyector nanoliter fijada en 55 nl / seg. Ejecutar este paso rápidamente a medida que la gotita se evapore. Mueva el capilar al sitio of inyección y moverlo hacia abajo hasta que la punta toca la superficie pial. Cambiar el valor del eje dorso-ventral (z) a 0. En este punto, penetrar en el tejido con el capilar de -1,9 mm y suelte 1,5 l de suspensión viral a una velocidad de 4 nl / s. Espere 2-3 minutos para minimizar el flujo de retorno de la cubeta de suspensión viral de la pista capilar y luego retraer el capilar. Una segunda inyección se puede realizar en el hemisferio contralateral. Suturar la piel, desinfectar, y permitir que el animal se recupere de la anestesia como se describe anteriormente en el útero para electroporación (1,8). Figura 2. Inyección estereotáxica viral. (A y B) Representación esquemática de los componentes necesarios para realizar la inyección estereotáxica (A) y un soporte desmontado capilar que muestra la inserción de un capillary hasta que el segundo anillo (B). (C) Imagen de la cabeza de ratón inmovilizado por las barras para los oídos y el apoyo paladar con la piel cortada para exponer el cráneo (a la izquierda). La ampliación del cuadro de puntos (derecha) muestra las suturas laterales y sagital, el bregma, y ​​el sitio de la inyección (círculo). 3. Procesamiento de la muestra Uno a tres semanas después de la infección, perfundir el ratón con ca. 100 ml de 4% de PFA, diseccionar el cerebro y posfijo de toda la noche en 4% de PFA. Eventualmente, BrdU y / o el tamoxifeno se puede administrar antes de sacrificio de acuerdo a diferentes paradigmas para investigar la cinética del ciclo celular y para detener la expresión de los transgenes virales flanqueado por sitios loxP, respectivamente 9. Entonces, el cerebro pueden ser procesados ​​para inmunotinción usando varios marcadores de células madre y progenitoras y las neuronas (por ejemplo, Sox2, GFAP, nestina, Tbr2, doublecortin, etc).