Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем<em> В Utero</em> Электропорации или вирусных Стереотаксическая инъекций

Предварительное замечание Операция должна быть выполнена полностью подготовленных следователей по согласованию с местными органами власти для животных. Все меры предосторожности должны быть приняты, чтобы минимизировать боль и стресс причиненного животным, включая глубокий наркоз, администрация послеоперационного обезболивания, а для операции длительностью более 10 мин, применение глаз смазкой, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы и слепоту. Наркозом мышей должен постоянно теплая при 37 ° С до полного выздоровления, и каждый хирургический инструмент и решения должны быть стерильными. Хотя использование биологических капот не является строго необходимым, оператор должен принять все разумные меры, чтобы свести к минимуму возможность заражения животного во время операции, надев халат, маску и перчатки. Кроме того, каждый шаг в области сбора и использования вирусов должны быть разрешены и должны быть выполнены в S2 районы в соответствии с нормативными правовыми актами местных органов власти.Наконец, тщательное обеззараживание всех инструментов и поверхностей, которые могли быть в контакте с вирусами должны быть выполнены в соответствии с утвержденными центр дезинфекции практики (на ВИЧ, вытирая с 70% Et-OH и / или автоклавирования). Часть 1: Расширение эмбриональные НСК 1. Кроме электропорации внутриутробно После клонирования трансгенов (т.е. cdk4/cyclinD1) в ПКМ-EGFP (Clontech) или pDSV-mRFPnls векторов 16, очистить плазмид использованием EndoFree комплект и ресуспендируют в стерильном PBS до концентрации 3-5 мкг / мкл. Вскоре перед операцией, смешать плазмид с 0,05% FastGreen в PBS в конечной отношение ок. 4:04:01 и центрифугируют смесь в течение 2 мин при 16000 мкг, чтобы удалить все осадки. Загрузите ДНК смесь в ранее вытащил из боросиликатного стеклянный капилляр. Тяговая параметров с помощью P-97 пипетки съемника являются: тяга: 200; Vel: 140; время: 140. Тепло дает рампы теста и зависит от спецификацииБР много капилляров используется. Установите капиллярную на сопло PicoPump, что находится недалеко от внутриутробного электропорации платформу (рис. 1а), а при стереомикроскопа, согнуть ее кончик и ник он в точке перегиба. Стерилизовать всех хирургии инструменты в сухом стерилизаторе стеклянная бусина и глубоко обезболить беременных мышей на 12-15 день беременности использовании изофлурана испарителя. Поместите животных в положении лежа на спине на отопление установлен на уровне платформы 37 ° C и держать под постоянным изофлуран администрации через носовой конус. Бритье кожи живота, дезинфекции Betaisodona несколько раз, в конце концов вытирая между ними с 70% этанола, и придать бупренорфин (разводят в PBS) подкожно в дозе 0,1 мг / кг концентрация в качестве преимущественного анальгетик. Использование тонких ножниц, сделать 2 см продольный разрез кожи и, соответственно, базового мышечной стенки для доступа в брюшную полость. Внесите в брюшной полости около. 2ИЭГ мл раствора (D-PBS, содержащий 100 ЕД / мл пера / стрептококковая), предварительно нагретой при 37 ° C и поддерживать решения на нагревательный блок. Крышка мыши стерильной Drap содержащих трещины, из которых матки будет удалена. Уберите разрез использованием вольфрамового втягивающим, определить матки и вытащить его держа его пинцетом между соседними эмбрионов (рис. 1б; слева) и, наконец, отдать ее на стерильную Drap. Во время всей операции, промыть матки с IUE решение для увлажнения органов и полости тела и предотвращает обезвоживание животных. Ручка матки тщательно держа ее между большим и указательным и превратить одного эмбриона до его голова видна и ориентирован на оператора. Определение конечного мозга полушарий и ввести одну из них из спинно-боковой стороны. Выпуск 1-2 мкл раствора ДНК помощью педали из PicoPump пока желудочка очерчена FastGreen (рис. 1б; справа). <lI> Место анода электродов на месте инъекции и катод на противоположной стороне (рис. 1С) и доставить 6 импульсов 30 В в течение 50 мс с 950 мс интервал между импульсами использованием электропоратора генерации квадратный электрических полях работают с помощью педали. Избегайте размещения электродов близка к плаценте, так как это может вызвать кровотечение и повреждение эмбриона. Когда все эмбрионы вводят и электропорации, поместить в матку обратно в брюшную полость и закрыть мышечной стенки с шовный строку ушивание каждые 3-4 мм. Узлы должны быть плотно к мышце, но не слишком туго, чтобы немного отек тканей. Наконец, закройте вышележащих кожи с помощью металлических зажимов. Лечить кожу Betaisodona, удалите мышь от изофлуран маску и передать его в корпус клетке, когда окончательно проснулся. Следить за восстановление мыши, пока опорно-двигательного поведение является нормальным. 2. Обработка образцовPLE Один или несколько дней после электропорации, пожертвовать мыши, сбор эмбрионов и определить те правильно электропорации с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (рис. 1D). Препарировать мозг на ледяной PBS, и закрепить их на ночь в 4% PFA (параформальдегида в фосфатный буфер рН 7,4). В конце концов, BrdU может быть введен до жертвы по разным парадигмам, чтобы исследовать кинетику клеточного цикла и пролиферации клеток 3. Мозги затем обрабатываются для резки и иммунной для нескольких маркеров радиальной глии, базальные предшественников и нейроны (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 и т.д.), чтобы оценить эффект функционального трансгенов на целевые НБК и их потомства, которые определены по выражению совместно электропорации гена-репортера. Рисунок 1.В электропорации внутриутробно. (А) Схематическое представление в платформу электропорации внутриутробно. (B) чертежи с указанием расположения беременной мыши во время операции (справа) и инъекции ДНК / FastGreen смеси (синий) в полушария конечного мозга эмбриона мыши (слева). (C) схема, показывающая расположение электродов в контакте с маточной стенки с анода (+) рядом с местом инъекции (синий). Стрелки указывают на миграцию ДНК к аноду. (D) Изображение эмбриона мыши через 24 часа после электропорации с плазмидами GFP в эмбриональный день 13. Пунктирная линия разграничивает конечного мозга полушария. Схема в редактировался Calegari и соавт., 2004 17. Часть 2: Расширение взрослых НСК 1. Производство ВИЧ-вирусных частиц, полученных День 1: плита 5 х 10 6 клеток 293Т на 10 смБлюдо с 8 мл D-MEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД / мл ручка / стрептококковой (культуральная среда). Использование 15 блюд для одного вирусного препарата и культуры в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2. День 2: для каждого блюда, развести в 1 мл простого D-MEM 5 мкг каждого из 3 плазмиды, кодирующие я) VSVG (везикулярного стоматита типа вируса G) белок оболочки, II) кляп / Pol (группа специфический антиген / полимераза) и III) полицистронный построить выражающих функциональную и репортер трансгенов (т.е. cdk4/cyclinD1/GFP), ранее клонированы в ВИЧ на основе вектора переноса (p6NST90) 9. Смешайте этот раствор по 1 мл D-MEM, содержащую 45 мкл полиэтиленимин, которые были предварительно растворенного в PBS в концентрации 1 мг / мл маточного раствора и инкубировать в течение 15-30 мин при комнатной температуре. В то же время, извлеките носитель из клеток и добавляют 4 мл на чашку свежего D-MEM, содержащей 15% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД / мл ручка / стрептококк. Добавить 2 мл смеси трансфекции и культуры в течение ночи. День 3: добавить 120 мкл 500 мМ Na-бутират за блюдо для повышения экспрессии трансгенов, аккуратно перемешать и культуры в течение 6-8 часов, после чего заменить трансфекции среду с 5 мл питательной среды. День 4: собирают супернатант (около 70 мл общего объема), проходит через фильтр 0,22 мкм и передачи в 2 polyallomer пробирок (35 х 89 мм). Ультрацентрифуга на 110000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием качели ротора. Удалите супернатант, добавить 6 мл PBS в каждую пробирку и инкубируют на льду в течение 1 часа. Ресуспендируют гранул и передать его в одном polyallomer центрифужные пробирки (14 х 95 мм). Ультрацентрифуга на 110000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием качели ротора. Удалите супернатант, ресуспендируют осадок в 50 мкл PBS, составит 5 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C. Титр вируса будет находиться в диапазоне 10 8 -10 9 КОЕ / мл. (Примечание: вирусы очень чувствительны к температуре и хранения, AVOID повторного замораживания, держать в сухом льду во время транспортировки и скоро оттепель перед использованием.) 2. Стереотаксическая инъекций Anesthetize 6-10 недель мыши с изофлурана и поместить животное в положении лежа на стереотаксической рамы (рис. 2A) с помощью уха баров и неба поддержке должным образом зафиксировать голову. Животное теплым на грелку установлен на уровне 37 ° С и при постоянном изофлуран администрации. Вводят подкожно по 100 мкл рабочего раствора бупренорфина в качестве преимущественного обезболивающее, бритье полоса кожи на голове мыши, и desinfect, как описано в 1.4. Использование скальпеля, сделать ок. 1,5 см длиной продольный разрез на коже головы подвергая черепа на уровне сагиттального шва. Уберите кожи и осторожно очистите поверхность кости стерильным ватным тампоном. Half-заполнит стеклянный капилляр (спецификации 1.2) с парафиновой нефти и смонтировать его на насос-форсунка вставкикапиллярная до второго кольца (рис. 2В). Перемещение капиллярной держатель на оси х, у и г до кончика капилляра расположен на брегмы, совместно точке между сагиттальной и боковые швы (рис. 2) (будет определяться с помощью стереомикроскопа), и повторного набора х, у, г значения на 0. Переместить капилляра ± 1,6 мм в медио-поперечной оси (х) и -1,9 мм в передне-задней оси (у) и отметьте кости с помощью хирургического маркером. Сделайте отверстие ок. Диаметром 0,5 мм на черепе с помощью электрической бурильщика обращая внимание, чтобы не повредить мозг. Положить 5 мкл капли вирусной суспензии (1 аликвоты) на куске парафильмом размещены на ухо баров и погрузиться наконечник капилляра в капле. Сосать ок. 3,5 мкл вирусной суспензии использованием nanoliter инжектор установлен на уровне 55 л / сек. Выполнение этого шага быстро, как капли будут испаряться. Перемещение капиллярной на сайт оинъекций F и переместите его вниз, пока кончик не коснется поверхности мягкой мозговой оболочки. Сброс спинно-вентральной оси значений (г) до 0. На данный момент, проникают в ткани с капиллярной за -1,9 мм и отпустите 1,5 мкл вирусной суспензии в размере 4 NL / сек. Подождите 2-3 минуты, чтобы свести к минимуму обратного вирусного корыта подвески капиллярной дорожке, а затем убрать капилляров. Вторая инъекция может быть выполнена в controlateral полушарии. Шва кожи, вылечить, и позволяют животному, чтобы оправиться от наркоза, как описано выше для внутриутробно электропорации (1,8). Рисунок 2. Стереотаксическая вирусные инъекции. (А и B) Схематическое изображение компонентов, необходимых для выполнения стереотаксической инъекции (А) и разобрали капиллярной держатель показывает вставки окpillary до второго кольца (B). (C) Изображение мыши голову иммобилизованных на слух баров и неба поддержку с кожей разрезать, чтобы разоблачить черепа (слева). Увеличение пунктирную рамку (справа) показывает, боковые и сагиттального швов, брегмы, и в месте инъекции (круг). 3. Обработка образца Один-три недели после заражения, заливать мыши с ок. 100 мл 4% PFA, препарировать мозг и пост-это исправить в течение ночи в 4% PFA. В конце концов, BrdU и / или тамоксифен может быть введен до жертвы по разным парадигмам, чтобы исследовать кинетику клеточного цикла и, чтобы остановить выражение вирусных трансгенов в окружении сайтов loxP, соответственно, 9. Мозг может быть обработан для иммунной использовании нескольких маркеров стволовых и предшественники клеток и нейронов (например, Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin и т.д.).