Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme
Summary
Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları vardır<sup> 1-4</sup>. Burada fungal patojen kullanarak Zebra balığı larvası bulaştırdıkları teknikleri göstermek<em> Candida albicans</em> Mikroenjeksiyon tarafından, metodoloji son zamanlarda mantar dimorfizm kontrolü fagosit NADPH oksidaz aktivitesi bulaştırmak için kullanılan<sup> 5</sup>.
Abstract
Patojen Candida albicans neden olduğu yaygın kandidiyazis yatan bireylerde klinik olarak önemli bir sorundur ve bir% 30-40 ölüm atfedilebilen 6 ile ilişkilidir. Sistemik kandidiyazis normalde doğal bağışıklığın tarafından denetlenir ve bu tür fagosit NADPH oksidaz gibi doğuştan gelen bağışıklık hücre bileşenleri genetik bozuklukların bireylerin kandidemi 7-9 daha duyarlıdırlar edilir. Çok az C. dinamikleri hakkında bilinmektedir in vivo olarak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile albicans etkileşim. in vitro çalışmalar Kapsamlı kurduk ana C. dışında albicans, makrofajlar içinde filizlenir ve hızlı bir şekilde nötrofil 10-14 tarafından yok edilir. In vitro çalışmalar, faydalı olsa da, sitokin düzeyleri, hücre dışı matriks ekleri ve hücreler arası iletişim 10 zamana bağlı dinamiklerini içeren in vivo ortamda, karmaşık özetlemek olamaz 15-18 </sup>. -Konak etkileşimi bu faktörlerin katkısını araştırmak için, canlı bir sağlam ev sahibi olarak non-invaziv enfeksiyon bu yönleri görselleştirmek için bir model organizma bulmak için önemlidir.
Zebra balığı larva enfeksiyon çalışma için benzersiz ve çok yönlü bir omurgalı sunar. Gelişim zebrabalıkları larvaların ilk 30 gün için sadece doğuştan gelen bağışıklık sistemi 2, 19-21 gibi doğal bağışıklığın çok bağımlı dissemine kandidiyazis gibi hastalıkların çalışma basitleştirilmesi, var. Zebra balığı larva küçük boyutu ve şeffaflığı hem de ev sahibi ve patojen için hücresel düzeyde enfeksiyon dinamiklerinin görüntüleme sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri floresanlama ile Transgenik larvalarının enfeksiyon 22-24 dahil belirli hücrelere türlerini tanımlamak için kullanılır. Modifiye anti-sense oligonükleotidler (Morpholinos) gibi fagosit NADPH oksidaz gibi çeşitli bağışıklık bileşenleri yıkmak ve funga yanıt değişiklikleri incelemek için kullanılabilirl enfeksiyonu 5. Küçük bir düşük omurgalı kullanılarak etik ve pratik bir avantaj ek olarak, resim her iki zebrafish larvaları intravitally ve renk açısından patojen ve ev sahibi arasındaki eğimli mücadele etmek eşsiz olasılığını sunar.
Zebra balığı, insan patojen bakterilerin bir dizi model enfeksiyon için kullanılır olmuştur ve mikobakteriyel enfeksiyonu 3, 25 anlayışımızda önemli gelişmeler etkili olmuştur. Bununla birlikte, sadece son larvası 5 gibi enfekte etmekte kullanıldığında edilmiş mantarlar, 23, 26 gibi daha büyük patojenler sahiptir ve enfeksiyona yöntem ayrıntılı bir açıklaması görsel olmamıştır güncel. Burada daha önceki protokollere bizim değişiklikler dahil olmak üzere prim 25 zebrabalıkları ve arka beyin ventrikül mikroenjeksiyon için, teknikler sunuyoruz. Mantar enfeksiyonu için larva zebrabalıkları modeli kullanarak Bulgularımız in vitro çalışmalar uzaklaşacak ve konak-patojen Intera incelemek gerekli kılmaktadıryerine Petri tabağı 5 basitleştirilmiş sistem daha konağın kompleksi ortamda ction.
Protocol
Discussion
Burada sunulan zebrabalıkları mikroenjeksiyon yöntemi Gutzman ark farklıdır. 34 burada biz 36-48 hpf larvaların arka beyin ventrikül içine otik vezikül ile enjeksiyon göstermektedir. Bizim tarif ettiğimiz yöntem düşük doku hasarı ile arka beyin ventrikül içine 10-15 maya tutarlı enjeksiyon için izin verir. Bu protokol 24 hpi (Şekil 1) ve önemli öldürücülüğü / morbidite 5 sonuçları ile vücuda yayılır bir başlangıçta lokal enfeksiyon üre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ekipman embriyo gelişimi ve kullanımı hızlandırmak konusunda tavsiye için mikroenjeksiyon eğitim, Clarissa Henry Dr Carol Kim laboratuar teşekkür ve fli1 katkıda bulunmak için Nathan Lawson olurdu: EGFP balık. Biz yazının eleştirel okuma için Wheeler laboratuar ve Shawn Duvarlar üyelerine teşekkür ediyorum. Biz de bu proje üzerinde teknik danışmanlık için balık bakımı ve tavsiye için Mark Nilan, ve Ryan Phennicie ve Kristin Gabor teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma K. Kardeşler, bir MAFES Hatch hibe E08913-08, ve R. Wheeler bir NIH NCRR ödülü P20RR016463 bir MAFES araştırma görevliliği tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
| 1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
| Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
| Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
| Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
| Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
| HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
References
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
- Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
- Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
- de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
- Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
- Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
- Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
- Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
- Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
- Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
- Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
- Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
- Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
- Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
- Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
- Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
- Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
- van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).
