Summary

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Published: July 30, 2012
doi:

Summary

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la infección<sup> 1-4</sup>. Aquí nos demuestran técnicas para infectar larvas de pez cebra con el hongo patógeno<em> Candida albicans</em> Por microinyección, la metodología usada recientemente para implicar a la actividad de los fagocitos de la NADPH oxidasa en el control del dimorfismo de hongos<sup> 5</sup>.

Abstract

La candidiasis diseminada causada por el patógeno Candida albicans es un problema clínicamente importante en individuos hospitalizados y se asocia con una mortalidad de 30 a 40% atribuible 6. La candidiasis sistémica es normalmente controlada por la inmunidad innata, y las personas con defectos genéticos en los componentes de células inmunes innatas como la NADPH oxidasa fagocítica son más susceptibles a la candidemia 7-9. Muy poco se sabe sobre la dinámica de la C. la interacción albicans con las células inmunes in vivo. extensa en estudios in vitro han demostrado que fuera del huésped C. albicans, germina en el interior de los macrófagos, y es rápidamente destruido por los neutrófilos 10-14. Los estudios in vitro, aunque útil, no se puede resumir el complejo en un entorno vivo, que incluye el tiempo que dependen de la dinámica de los niveles de citoquinas, archivos adjuntos de la matriz extracelular, y los contactos intercelulares 10, 15-18 </sup>. Para investigar la contribución de estos factores en la interacción huésped-patógeno, es fundamental para encontrar un organismo modelo para visualizar estos aspectos de la infección de forma no invasiva en un huésped vivo intacta.

La larva de pez cebra ofrece un hospedador vertebrado único y versátil para el estudio de la infección. Durante los primeros 30 días de desarrollo de larvas de pez cebra sólo tienen defensas inmunológicas innatas 2, 19-21, lo que simplifica el estudio de enfermedades como la candidiasis diseminada que son altamente dependientes de la inmunidad innata. El pequeño tamaño y la transparencia de las larvas de pez cebra permitirá imagen de la dinámica de la infección a nivel celular, tanto para hospedante y el patógeno. Larvas transgénico con fluorescencia células inmunes puede utilizarse para identificar los tipos de células específicos implicados en la infección 22-24. Modificados oligonucleótidos antisentido (Morpholinos) se puede utilizar para derribar varios componentes inmunes como la NADPH oxidasa fagocítica y estudiar los cambios en respuesta a fungal infección 5. Además de las ventajas prácticas y éticas de la utilización de un pequeño vertebrado inferior, las larvas de pez cebra ofrece la posibilidad única de la imagen de la batalla campal entre patógeno y huésped tanto intravitally y en color.

El pez cebra se ha utilizado para la infección de modelo para una serie de bacterias patógenas humanas, y ha sido instrumental en importantes avances en nuestra comprensión de la infección por micobacterias 3, 25. Sin embargo, sólo recientemente han patógenos mucho más grandes tales como hongos han utilizado para infectar larva 5, 23, 26, y hasta la fecha no ha habido una descripción visual detallada de la metodología de la infección. Aquí les presentamos nuestras técnicas de microinyección cerebro posterior del ventrículo de Prim 25 el pez cebra, incluyendo nuestras modificaciones de los protocolos anteriores. Nuestros resultados con el modelo de larvas de pez cebra para la infección por hongos difieren de los estudios in vitro y refuerzan la necesidad de examinar la intera huésped-patógenocción en el complejo entorno de la máquina en lugar del sistema simplificado de la placa de Petri 5.

Protocol

Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron bajo Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) de protocolo A2009-11-01. 1. Morfolino y platos de larvas de inyección Experimental Duración: * (10-15 minutos) Grado de dificultad: * Para inyecciones de huevo, preparar una solución al 2% de agarosa en agua estéril y microondas. Cuando la solución…

Discussion

El método de la microinyección de pez cebra que aquí se presenta se diferencia de Gutzman et al. 34 en que aquí se demuestra la inyección a través de la vesícula ótica en el ventrículo posterior del cerebro de 36 a 48 larvas de HPF. El método que permite describir para inyección consistente de 10-15 levadura en el ventrículo rombencéfalo con daño tisular reducida. Este protocolo produce una infección local que inicialmente se extiende por todo el cuerpo en un 24 hpi (Figura 1)<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al laboratorio de la Dra. Carol Kim para la formación de microinyección, Clarissa Henry para el asesoramiento relativo a la aceleración el desarrollo del embrión y el uso de los equipos, y Nathan Lawson para contribuir FLI1: peces EGFP. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Wheeler y Shawn Paredes para la lectura crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer a Mark Nilan para el cuidado de los peces y el asesoramiento, y Ryan Phennicie y Gabor Cristina de asesoramiento técnico sobre este proyecto. Este trabajo fue financiado por una ayudantía de investigación MAFES a los hermanos K., MAFES Hatch subvención E08913-08, y un premio de los NIH CNRR P20RR016463 a R. Wheeler.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
Spawning tanks Aquatic habitats  2L  
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C  
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z  
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M  
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726  
Peptone VWR Scientific 90000-264  
Dextrose Fisher Scientific D16-1  
Agar VWR Scientific 90000-760  
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468  
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986  
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806  
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722  
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner 
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU  
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP  
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW  
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33  
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base  
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222  
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base  
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system  
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific  TC-7  
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F  
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007  
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

References

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Cite This Article
Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

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