Summary

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Published: July 30, 2012
doi:

Summary

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op infecties<sup> 1-4</sup>. Hier laten we zien technieken voor het infecteren van zebravis larven met behulp van de schimmel<em> Candida albicans</em> Door micro-injectie, de methodologie voor kort gebruikt om fagocytensysteem NADPH oxidase activiteit betrokkenheid bij de controle van schimmel dimorfisme<sup> 5</sup>.

Abstract

Verspreid candidiasis door het pathogeen Candida albicans een klinisch belangrijke probleem opgenomen personen en is verbonden met 30 tot 40% aan mortaliteit 6. Systemische candidiasis wordt normaliter gestuurd door aangeboren immuniteit, en personen met genetische defecten bij aangeboren immuunresponsen cel componenten, zoals fagocytensysteem NADPH oxidase zijn vatbaarder voor candidemia 7-9. Er is weinig bekend over de dynamiek van C. albicans interactie met aangeboren immuunsysteem cellen in vivo. Uitgebreide in-vitro studies hebben aangetoond dat buiten de gastheer C. albicans kiemt binnenzijde van macrofagen en wordt snel vernietigd door neutrofielen 10-14. In vitro studies zijn nuttig, kan het complex niet vatten in vivo omgeving, tijdsafhankelijke dynamiek van cytokineniveaus, extracellulaire matrix bijlagen en intercellulaire contacten 10 omvat, 15-18 </sup>. Om sonde de bijdrage van deze factoren in gastheer-pathogeen interactie, is het essentieel om een ​​model organisme te vinden voor deze aspecten van de infectie te visualiseren niet-invasieve in een live intact host.

De zebravis larve biedt een unieke en veelzijdige gewervelde gastheer voor de studie van de infectie. Voor de eerste 30 dagen van de ontwikkeling zebravis larven hebben alleen aangeboren afweersysteem 2, 19-21, de vereenvoudiging van de studie van ziekten zoals gedissemineerde candidiasis die sterk afhankelijk zijn van aangeboren immuniteit. Het kleine formaat en de transparantie van de zebravis larven kunnen beeldvorming van de infectie dynamiek op cellulair niveau voor zowel de gastheer en ziekteverwekker. Transgene larven met fluorescerende aangeboren immuunsysteem cellen kunnen worden gebruikt om bepaalde types cellen betrokken bij infectie 22-24 identificeren. Gemodificeerde antisense oligonucleotiden (Morpholinos) kan worden gebruikt voor het neerslaan verschillende immuun componenten zoals fagocyt NADPH oxidase en bestuderen als reactie op Fungal infectie 5. In aanvulling op de ethische en praktische voordelen van het gebruik van een kleine lagere gewervelde, de zebravis larven biedt de unieke mogelijkheid om het imago van de veldslag tussen pathogeen en gastheer zowel intravitally en in kleur.

De zebravis is gebruikt om het model-infectie voor een aantal menselijke pathogene bacteriën, en heeft bijgedragen tot de grote vooruitgang in ons begrip van mycobacteriële infectie 3, 25. Echter, pas onlangs hebben veel grotere pathogenen zoals schimmels zijn gebruikt om larven te infecteren 5, 23, 26, en tot op heden is er geen sprake van een gedetailleerde visuele beschrijving van de infectie methodologie. Hier presenteren we onze technieken voor achterhersenen ventrikel micro-injectie van prim 25 zebravis, met inbegrip van onze wijzigingen naar de vorige protocollen. Onze bevindingen met behulp van de larven zebravis model voor een schimmelinfectie afwijken van de in vitro studies en versterken de noodzaak om de gastheer-pathogeen Intera te onderzoekenActies in de complexe omgeving van de gastheer in plaats van de vereenvoudigde regeling van de petrischaal 5.

Protocol

Alle zebravis zorgprotocollen en experimenten werden uitgevoerd onder Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocol A2009-11-01. 1. Morfolino en larvale Injection Dishes Experimentele duur: * (10-15 minuten) Moeilijkheidsgraad: * Voor ei injecties, stelt een 2% agarose oplossing in steriel water en een magnetron. Wanneer de oplossing is afgekoeld giet er wat van in een extra …

Discussion

De zebravis micro-injectie methode hier gepresenteerde verschilt van Gutzman et al.. 34 in dat we hier laten zien injectie door de otic blaasje in de achterhersenen ventrikel van 36 tot 48 hpf larven. De methode beschreven zorgt voor consistente injectie van 10-15 gist in het achterhersenen ventrikel met verminderde weefselbeschadiging. Dit protocol levert een eerste lokale infecties die door het lichaam verspreiden met 24 hpi (figuur 1) en resulteert in significante letaliteit / mor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag naar het laboratorium van Dr Carol Kim te bedanken voor micro-injectie opleiding, Clarissa Henry voor advies over de bespoediging ontwikkeling van het embryo en het gebruik van apparatuur, en Nathan Lawson om bij te dragen fli1: EGFP vis. Wij danken de leden van de Wheeler lab en Shawn Muren voor de kritische lezing van het manuscript. Wij zouden ook graag Mark Nilan voor vissen zorg en advies, en Ryan Phennicie en Kristin Gabor bedanken voor technisch advies over dit project. Dit werk werd gefinancierd door een MAFES onderzoek assistentschap aan K. Brothers, een MAFES Hatch subsidie ​​E08913-08, en een NIH NCRR award P20RR016463 naar R. Wheeler.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
Spawning tanks Aquatic habitats  2L  
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C  
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z  
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M  
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726  
Peptone VWR Scientific 90000-264  
Dextrose Fisher Scientific D16-1  
Agar VWR Scientific 90000-760  
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468  
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986  
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806  
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722  
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner 
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU  
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP  
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW  
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33  
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base  
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222  
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base  
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system  
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific  TC-7  
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F  
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007  
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

References

  1. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
  2. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  3. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
  4. Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
  5. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  6. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
  7. Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
  8. de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
  9. Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
  10. Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
  11. Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
  12. Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
  13. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
  14. Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
  15. Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
  16. Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
  17. Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
  18. Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
  19. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
  20. Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
  21. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
  22. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
  23. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
  24. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  25. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
  26. Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
  28. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  29. Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  30. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  32. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
  33. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  34. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  35. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  36. Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
  37. Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  38. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  39. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
  40. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  41. Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
  42. Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
  43. Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
  44. van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  45. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
  46. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).

Play Video

Cite This Article
Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

View Video