غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد
Summary
والتطوير السريع، وصغر حجمها والشفافية من الزرد هي مزايا هائلة لدراسة سيطرة المناعة الفطرية للعدوى<sup> 1-4</sup>. هنا علينا أن نبرهن تقنيات لاصابة يرقات اسماك الزرد باستخدام العوامل المسببة للأمراض الفطرية<em> المبيضات البيض</em> من جانب microinjection، المنهجية المتبعة في الآونة الأخيرة لتوريط بلعمية النشاط أوكسيديز NADPH في السيطرة على إزدواج الشكل الفطرية<sup> 5</sup>.
Abstract
المبيضات نشر الناجمة عن المبيضات البيض الممرض هي مشكلة هامة سريريا في المستشفى الأفراد ويترافق مع معدل وفيات 1 تعزى 30 إلى 40٪ 6. ويتم التحكم عادة المبيضات الأجهزة عن طريق المناعة الفطرية، والأفراد ذوي العيوب الوراثية في الخلايا المناعية الفطرية مكونات مثل NADPH أوكسيديز بلعمية هم اكثر عرضة لالمبيضات 7-9. ولا يعرف سوى القليل جدا عن القوى المحركة للC. وقد أنشأت المبيضة البيضاء التفاعل مع الخلايا المناعية الفطرية في الجسم الحي. واسعة في الدراسات المختبرية التي من خارج جيم المضيفة المبيضة البيضاء تنبت داخل الضامة، ويتم تدمير بسرعة من قبل العدلات 10-14. الدراسات في المختبر، على الرغم من المفيد، لا يمكن أن ألخص المجمع في بيئة الجسم الحي، والذي يتضمن الساعة التي تعتمد على ديناميات مستويات خلوى، التجهيزات المصفوفة خارج الخلية، والاتصالات بين الخلايا 10، 15-18 </sup>. للبحث في مساهمة هذه العوامل في المضيف الممرض التفاعل، من المهم جدا للعثور على كائن نموذج لتصور هذه الجوانب من عدوى غير جراحية في المضيف سليمة حية.
اليرقة الزرد توفر مجموعة الفقاريات وتنوعا فريدا لدراسة العدوى. عن ال 30 يوما الأولى من يرقات اسماك الزرد تنمية لديها دفاعات المناعة الفطرية فقط 2، 19-21، وتبسيط دراسة الأمراض مثل داء المبيضات نشر التي تعتمد اعتمادا كبيرا على الحصانة الفطرية. حجم صغير والشفافية من يرقات اسماك الزرد تمكين التصوير ديناميات العدوى على المستوى الخلوي لكل من المضيف والممرض. ويمكن استخدام اليرقات المعدلة وراثيا مع الاستشعاع خلايا المناعة الفطرية للتعرف على أنواع معينة الخلايا المشاركة في عدوى 22-24. ويمكن استخدام تعديل المضادة للإحساس [أليغنوكليوتيد] (Morpholinos) لاسقاط المكونات المناعية المختلفة مثل NADPH أوكسيديز بلعمية ودراسة التغيرات في الاستجابة لfungaل إصابة 5. بالإضافة إلى المزايا الأخلاقية والعملية لاستخدام أقل الفقاريات الصغيرة، ويرقات اسماك الزرد توفر إمكانية فريدة من نوعها لصورة معركة ضارية بين الممرض والمضيف على حد سواء وintravitally في اللون.
وقد استخدم الزرد إلى عدوى نموذج لعدد من البكتيريا المسببة للأمراض البشرية، وقامت بدور فعال في تقدم كبير في فهمنا للعدوى المتفطرات 3 و 25. ومع ذلك، إلا في الآونة الأخيرة أن العوامل الممرضة أكبر من ذلك بكثير مثل الفطريات قد استخدمت لنقل العدوى يرقة 5، 23، 26، وحتى الآن لم يكن هناك وصفا تفصيليا للمنهجية البصرية عدوى. هنا نقدم تقنيات لدينا microinjection بطين الدماغ المؤخر من الزرد 25 متزمت، بما في ذلك التعديلات التي نبذلها لالبروتوكولات السابقة. النتائج التي توصلنا إليها باستخدام نموذج الزرد اليرقات للعدوى فطرية تختلف من الدراسات في المختبر، وتعزيز الحاجة لدراسة intera المضيف الممرضction في البيئة المعقدة للمضيف بدلا من نظام مبسط للطبق بيتري 5.
Protocol
Discussion
طريقة microinjection الزرد المقدمة هنا يختلف عن Gutzman وآخرون (34). في ذلك هنا علينا أن نبرهن عن طريق حقن الحويصلة الأذنية إلى البطين الدماغ المؤخر من اليرقات HPF 36-48. الأسلوب وصفنا يسمح للحقن متسق من 10-15 الخميرة إلى البطين الدماغ المؤخر مع انخفاض تلف الأنسجة. هذا البروت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر مختبر الدكتور كارول كيم للتدريب microinjection، كلاريسا هنري لتقديم المشورة بشأن تسريع تطور الجنين واستخدام المعدات، وناثان لوسون للمساهمة fli1: EGFP الأسماك. ونحن نشكر أعضاء المختبر ويلر والحوائط شون لقراءة نقدية للمخطوطة. ونود أيضا أن نشكر مارك Nilan للرعاية الأسماك والمشورة، وريان Phennicie وجابور كريستين لتقديم المشورة الفنية في هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال مساعدة مالية البحوث MAFES إلى الإخوة ك، وهي هاتش MAFES منحة E08913-08، وجائزة NCRR المعاهد الوطنية للصحة P20RR016463 إلى يلر ر.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
| 1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
| Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
| Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
| Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
| Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
| HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
References
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
- Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
- Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
- de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
- Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
- Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
- Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
- Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
- Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
- Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
- Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
- Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
- Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
- Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
- Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
- Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
- Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
- van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).
