הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה
Summary
ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של זיהום<sup> 1-4</sup>. כאן אנו מדגימים טכניקות הדבקה הזחלים דג הזברה באמצעות הפתוגן פטרייתי<em> קנדידה אלביקנס</em> על ידי microinjection, המתודולוגיה בשימוש לאחרונה לערב פעילות תא בלען NADPH אוקסידאז שולט dimorphism פטרייתי<sup> 5</sup>.
Abstract
קנדידה להפיץ נגרמת על ידי פתוגן קנדידה אלביקנס היא בעיה חשיבות קלינית אצל אנשים מאושפזים והיא קשורה עם תמותה המיוחס 30 עד 40% 6. קנדידה מערכתית נשלטת בדרך כלל על ידי חיסון מולדת, אנשים עם פגמים גנטיים מולדים רכיבי תא החיסון כגון NADPH אוקסידאז תא בלען רגישים יותר candidemia 7-9. מעט מאוד ידוע על הדינמיקה של C. אלביקנס אינטראקציה עם תאים חיסוניים מולדים in vivo. נרחב במבחנה קבעו כי מחוץ המארח ג אלביקנס germinates בתוך מקרופאגים, והוא נהרס במהירות על ידי נויטרופילים 10-14. במבחנה, אך שימושי, לא יכול לשחזר מורכבים בסביבה vivo, הכולל זמן תלויי הדינמיקה של רמות ציטוקינים, קבצים מצורפים תאי מטריקס ואנשי קשר אינטר 10, 15-18 </sup>. כדי לבחון את התרומה של גורמים אלה באינטראקציה בין מאכסן לפתוגן, חשוב למצוא אורגניזם המודל לחזות היבטים אלה של זיהום הלא פולשני שורה שלמה חי.
הזחל דג הזברה מציע שורה חוליות ייחודי צדדי לחקר זיהום. במשך 30 הימים הראשונים של התפתחות הזחלים דג הזברה יש רק הגנה החיסון המולדת 2, 19-21, לפשט את חקר מחלות כמו קנדידה שהפיצו, כי הם תלויים במידה רבה חסינות מולדת. גודל שקיפות קטנה של דג הזברה הזחלים לאפשר הדמיה של הדינמיקה זיהום ברמה התאית עבור המארחת והן הפתוגן. הזחלים מהונדס עם קורנים תאים חיסוניים מולדים יכול לשמש כדי לזהות סוגים מסוימים תאים המעורבים זיהום 22-24. שונה נגד תחושת oligonucleotides (Morpholinos) ניתן להשתמש כדי להפיל רכיבים חיסוניים שונים כגון NADPH אוקסידאז תא בלען וללמוד את השינויים בתגובה fungaאני זיהום 5. בנוסף על היתרונות האתיים והמעשיים של השימוש חוליות נמוך קטן, הזחלים דג הזברה מציעה אפשרות ייחודית תמונת הקרב ודק בין הפתוגן ומארח הן intravitally וגם בצבע.
דג הזברה נעשה שימוש לזיהום מודל עבור מספר של חיידקים פתוגניים האדם, כבר סייעה התקדמות גדולה בהבנה שלנו של זיהום mycobacterial 3, 25. עם זאת, רק לאחרונה יש פתוגנים הרבה יותר גדול כמו פטריות השתמשו כדי להדביק את הזחל 5, 23, 26, ועד כה לא היתה תיאור ויזואלי מפורט של המתודולוגיה זיהום. כאן אנו מציגים טכניקות שלנו microinjection למוח האחורי החדר של דג הזברה 25 דקדקנית, כולל שינויים שלנו על הפרוטוקולים הקודמים. הממצאים שלנו תוך שימוש במודל דג הזברה הזחל על זיהום פטרייתי לסטות במבחנה ולחזק את הצורך לבחון בין מאכסן לפתוגן interaction בסביבה מורכבת של המארח ולא מערכת פשוטה של צלחת פטרי 5.
Protocol
Discussion
שיטת microinjection דג הזברה המוצג כאן שונה Gutzman et al. 34 ב שכאן אנחנו מדגימים הזרקת דרך שלפוחית otic לתוך החדר למוח האחורי של הזחלים hpf 36-48. השיטה מאפשרת לנו לתאר להזרקה קבועה של 10-15 שמרים לתוך החדר למוח האחורי עם נזק לרקמות מופחת. פרוטוקול זה מייצר זיהום מקומי בתחיל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות במעבדה של ד"ר קרול קים לאימונים microinjection, קלריסה הנרי עצה האצת פיתוח העובר ושימוש בציוד, ונתן לוסון לתרום fli1: דגים EGFP. אנו מודים לחברי המעבדה וילר קירות שון לקריאה ביקורתית של כתב היד. אנו רוצים גם להודות מארק Nilan לטיפול דגים עצות, ריאן Phennicie וקריסטין גאבור עבור ייעוץ טכני על הפרויקט הזה. עבודה זו מומנה על ידי אסיסטנט מחקר MAFES את האחים ק ', האץ' MAFES מענק E08913-08, וכן בפרס NCRR NIH P20RR016463 ר' וילר.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Spawning tanks | Aquatic habitats | 2L | |
| 1.7 mL tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Extra deep Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11Z | |
| Standard Petri dishes | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Disposable Hemocytometer | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Phosphate Buffered Saline | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Tweezers | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Wooden Dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| KimWipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Low Melt Agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarose for injection dishes | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Hollow glass rods | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner |
| Pipette Storage Box | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back Pressure Unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette Holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot Switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic Base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Imaging Dishes | MatTek Corporation | P24G-1.0-10-F | |
| Pipette tips for loading needles | Eppendorf | 930001007 | |
| Plate pouring grids | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Heated Stage | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Flat Spatula | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Plastic Sieves | Wares of Knutsford Online | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm Culture tubes | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Phenol Red | VWR Scientific | 97062-478 | |
| HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca(NO3)2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
References
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
- Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
- Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
- de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
- Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
- Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
- Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
- Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
- Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
- Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
- Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
- Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
- Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
- Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
- Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
- Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
- Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
- Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
- Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
- van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
- Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).
