Бесконтактная, этикетки без мониторинга клеток и внеклеточного матрикса использованием спектроскопии комбинационного

1. Подготовка биологических образцов Подготовка живых клеток Подготовка прилипшие клетки Семенной в пробирке-культурных или свежевыделенных клеток на блюдо со стеклянным дном (Greiner BioOne / Германия) и инкубировать их при 37 ° С и 5% CO 2 до клеточном завершена. Удалить культуральной среде и мытья аккуратно три раза PBS до измерения. Держите клетки покрыты либо PBS или среду клеточной культуры на всей процедуры измерения. Подготовка клеток в суспензии Снимите в пробирке, культивируемых клеток в соответствии с общими протоколами (например, трипсин-EDTA, сотовые выскабливание), центрифуги клетки и вновь приостановить получить осадок клеток в PBS или средней клеточной культуре. Передача 100 мкл клеточной суспензии (концентрация: макс. 100 000 клеток / мл), чтобы блюдо со стеклянным дном. Подготовка физив тканей После уборки тканей, перевести их в стерильной, ледяной PBS и держать их не более 12 часов при температуре 4 ° С или на льду до измерения. Предыдущие эксперименты показали, что длительный срок хранения (холодное время ишемии> 12 часов при температуре 4 ° С), в результате спектральные изменения, связанные с природными процессами деградации. Измерения должны быть выполнены с тканью рассматривается в PBS или средней, чтобы избежать повреждения белков ECM и клетки тканей из-за высыхания. 2. Спектрометр комбинационного Наши настроенные комбинационного спектрометра сочетает в себе стандартный флуоресцентного микроскопа (Olympus IX 71) с комбинационным спектрометр, который позволяет прямое сравнение светлого поля и флуоресцентных изображений с спектров комбинационного рассеяния. Основные настройки состоит из 784 нм лазерный диод (Toptica фотоники AG / Германия), режекторный фильтр для разделения комбинационного рассеянного света от возбуждающего света, микроскопм спектрограф (Kaiser оптических Systems, Анн-Арбор / США) с зарядовой связью (ПЗС), оптимизированных для определения спектральной информации (F-вид с Soft Systems Imaging / Германия). 3. Контроль лазерной функции Запустите программу Андор Солис (Андор / Великобритания) и установите температуру ПЗС-камеры до -60 ° C, чтобы минимизировать шум, вызванный термически индуцированных токов в камере. Поместите кремниевых пластин на предметный столик микроскопа для калибровки. Включите лазер и установить мощность до 85 мВт. Используйте программное обеспечение сотового B (Olympus / Германия), чтобы сфокусировать лазер на пластине до XY появляется. Измерьте кремниевых пластин с одним временем интегрирования 1 с помощью 60x цель воздуха. Изменение единицы оси Х от числа пикселей рамановского сдвига (см -1) в программном обеспечении Андор Солис. Вар лазерный фокус пика кремния при 520 см -1 всобранных спектра для того, чтобы найти максимально возможную интенсивность этой полосы КР. Минимальная сумма отсчетов должна быть выше, чем 11000 для успешной калибровки. 4. Комбинационного спектроскопических измерений Все измерения проводились при комнатной температуре. Основные параметры Используйте 60x цель погружением в воду (Olympus / Германия) с числовой апертурой 1,2 собрать спектр образцов. Измените настройки приобретение до 10 интеграций / 10 секунды на общую сумму 100 секунд в измерениях. Измерение прилипшие клетки Возьмите блюдо со стеклянным дном с клетками и поместить его на предметный столик микроскопа. Для того, чтобы получить лучший сигнал и обеспечить воспроизводимость, фокусировки лазерного на ядре клетки, поверните световой микроскоп и начать сбор спектра. Измерьте ссылкой спектр фоне электронной10 спектры очень перемещением лазерного фокуса у клетки. Важно учитывать, что при изменении фокуса новый фон должны быть собраны для каждой фокус глубину. Измерение клеток в суспензии Передача 100 мкл суспензии клеток в блюдо со стеклянным дном и поместите его на предметный столик микроскопа. Фокус на лазерном центре клетки, поверните световой микроскоп и начать сбор спектра. Измерьте ссылкой спектр фона каждые 10 спектров путем перемещения фокуса лазера рядом с ячейкой. При изменении фокуса, новый фон должны быть собраны для новой глубины фокуса. Измерение родной ткани Возьмите образец и поместите его в блюдо со стеклянным дном. Область интереса (ROI) должны быть ориентированы направлен к нижней части блюда. Заполните блюдо достаточно, чтобы покрыть PBS образца. Поместите крышку стекла по образцу, чтобы избежать любых мовВЫРАЖЕНИЕ образца в процессе измерения. Установите лазерный фокус в структуру интересов (глубина резкости является лазерная и ткань-зависимые) и начать собирать спектры. Соберите ссылкой спектр фона каждые 10 спектров путем перемещения лазерной внимание из всей площади ткани. При изменении фокуса, новый фон должны быть собраны для новой глубины фокуса. Измерение иммунофлюоресценции (ИФ)-меченных cryosections Раздел свежие, замороженные оснастки образцы тканей с использованием стандартного cryotom и смонтировать их на кремнезема покрытием покровных стекол. Пятно cryosections после обычного протокола для IF, используя только один шаг фиксации (не более 10 минут с 4% параформальдегид) и с помощью соответствующих антител для обнаружения белка интерес. Выполните измерения комбинационного внимание в районе, где происходит флуоресценция. Эксперименты эластина деградации Пласе ventricularis из расчлененных свиней аортального клапана листовки (эластин богатых, приток крови стороне слой листовки клапанов сердца), стоящих перед дно тарелки со стеклянным дном. Измерьте родной ткани, как «не-инкубационных контроль» на 30 случайных точек по всей поверхности ткани фокусировки в фибриллярных структур. Разделите образец на 3 части и поместить их в отдельный 2,5 мл Eppendorf трубы заполнены с 2 мл раствора эластазы (5 ЕД / мл, Уортингтон / Германия). Инкубируйте ткани для 15 или 30 минут при 37 ° C. После инкубации в течение 15 или 30 минут, снимите ткани из пробирки Эппендорф и мыть тщательно PBS, чтобы полностью остановить ферментативной реакции. Измерьте каждого образца на 30 случайных точек фокусировки в фибриллярных структур. 5. Обработки и анализа данных Обработки спектров комбинационного Предварительная обработкапорожденных спектров проводили с использованием программного обеспечения OPUS (Bruker Optik GmbH / Германия). В целях уменьшения помех от стекла и средних, а также, чтобы избежать изменений, вызванных изменениями в центре внимания во время измерений, вычесть соответствующие спектр фона от собранных спектров. Уменьшить спектров волновых области между 400-1800 см -1, которая предлагает самое большое количество информации. Если необходимо, нормализовать спектров к максимальной точке. Нормализация факторов из флуктуаций интенсивности и систематических отказов, упрощая выявление структурных изменений в образце спектров. Выполнять базовые поправки к увеличению сопоставимости между различными экспериментами. Анализ спектров комбинационного Спектров комбинационного рассеяния были проанализированы с использованием СПС с Unscrambler (CAMO / Норвегия) программного обеспечения. Это многофакторный анализ обнаруживает сходства и различия в спектральных данныхмножеств. Каждый спектр строится как единая точка в многомерном пространстве на основе собранных рассчитывает для каждой рамановского сдвига. Каждый принцип компонент (PC) описывает определенное количество общей информации, содержащейся в исходных данных. Первый компьютер, который содержит высокий источник изменчивости. Каждый следующий ПК содержит в порядке, меньше информации, чем предыдущий. Каждая переменная имеет счет и нагрузку на каждый ПК. Построив ПК (= баллов), важный пример корреляции могут быть выставлены. Нагрузки описать вклад каждого проанализированы переменной СПС. Пометьте каждую группу измерений, создав ряд диапазонов для каждой выборки. Используйте следующие основные параметры СПС: кросс проверки NIPALS алгоритм, без вращения и начала анализа. Эти параметры спектров зависимость. Выполните СПС. 6. Представитель Результаты Комбинационного зрectra полученные от прилипшие клетки часто обнаруживают низкий сигнал-шум и низкой общей интенсивности сигнала (рис. 1) 11. В связи с тем, что лазерный фокус должен быть установлен рядом со стеклянным дном, влияние интерферирующих стекло сигнала достаточно высока, в результате чего маскировка реального сигнала образца. Таким образом, выборка сигнала может быть сведено к минимуму или даже устранены в течение последующего вычитания фона. Таким образом, мы предпочитаем использовать клеток в суспензии для наших комбинационного спектроскопического анализа, так как они позволяют обнаруживать более детальной спектральной информации. Тем не менее, спектр сторонником и подвески клетки обладают теми же основные пики, отличающиеся только в их интенсивности. Для характеристики различных типов клеток в суспензии, без предварительной обработки не требуется. Средний спектров комбинационного рассеяния и стандартного отклонения фибробластов человека, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), хондроциты и кератиноцитов измеряется подвескиизображенный на рисунке 2. Все спектры комбинационного рассеяния аналогичным структурированные, с пиками, происходящих из типичных биомолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и липиды (см. Таблицу 1) 12. Для этих типов клеток, спектральную область между 600 и 1800 см -1, содержит наиболее важные спектральной информации, по который четкие различия обнаруживаются между различными типами клеток (рис. 2). Образцовый, мы подчеркнули одной спектральной области (1280-1350 см -1) отображение ясно структурные различия, которые назначаются на колебания молекул коллагена и липидов. В отличие от морфологического анализа не пригодны для идентификации и различия большинство клеток (рис. 2, б-I). Хотя разница между хондроцитов и клеток кожи наблюдается (рис. 2, H по сравнению с B, F и E, I), фибробластов и МСК трудно отделить использование исключительно светлого поля micrsocКопировать (рис. 2, F по сравнению с C, G) 13. Комбинационного спектроскопического анализа нативной ткани, в частности ECM белков, требует, чтобы рентабельность может быть визуализированы светлого поля изображения для того, чтобы иметь возможность сосредоточиться на соответствующие структуры. Для назначения белков к конкретной спектр отпечатки пальцев, мы получили спектры комбинационного рассеяния коммерчески доступных чистых белков и immunohistologically окрашенных cryosections. Здесь мы определили отпечатков пальцев спектр эластичных волокон в ткани родной сравнения лиофилизированный эластина и иммунофлюоресценции окрашенных cryosections использованием антител против эластина. Однако, так как эластин обладает высокой флуоресценции, что нашло отражение в спектрах комбинационного рассеяния, анализ данных является сложной задачей (рис. 3А). Чтобы уменьшить систематические неудачи из-за пример конкретных свойств, таких как флуоресценции, соответствующую обработку наборов данных имеет решающее значение. В наших данныхalyses, мы использовали нормализации устранить значительно выше интенсивности сигнала чистого белка эластина, и таким образом, мы смогли обеспечить сопоставимость спектров комбинационного рассеяния (рис. 3В). Эластин является одним из самых стабильных ECM белков в организме, и поэтому очень трудно ухудшить. 14 В нашей экспериментальной установки, мы индуцированных эластина деградации здоровых листовки аортального клапана свиньи, выполняя ферментативного пищеварения. Применение многомерного анализа СПС, мы обнаружили значительные различия между спектров комбинационного рассеяния ферментативно обработанных образцов и собственные элементы управления (рис. 3в). Эти спектральные различия наблюдались в спектре при нагрузке 861, 1003 и 1664 см -1. Ожидаемое структурных изменений в эластина содержащих волокна за счет продолжительного времени воздействия эластазы было показано окрашиванием HART (рис. 4), которые также были отражены в более четкой сепарабельных кластеров оценка (рис. 3C). Рисунок 1. Средний спектров комбинационного рассеяния отдельных и сторонник фибробластов. Рисунок 2. (А) Средние спектров комбинационного рассеяния и стандартные отклонения из четырех изолированных первичных типов клеток (фибробласты, МСК, хондроциты и кератиноцитов). Рама подчеркивает спектральной области 1280 – 1350 см -1 со структурными различиями. (BE) Светлое поле изображения отдельно (B) фибробласты, (C) МСК, (D) и хондроцитов (E) кератиноцитов. Шкала бар равен 20 мкм. (FI) Светлое поле изображения приверженцем (F) фибробласты, (G) МСК, (H) и хондроцитов (I) кератиноцитов. Масштаб панели равна 200 мкм. Рисунок 3. (A) спектров комбинационного рассеяния без нормализации lyophiliZED эластина (синяя линия), иммунофлюоресценции (ИФ)-меченных cryosections (оранжевая линия) и эластичных волокон (красная линия), измеренных в пределах родной листовки аортального клапана. Высокая интенсивность сигнала лиофилизированный эластина вызвано флуоресценции. (B) спектров комбинационного рассеяния после нормализации в целях устранения системных сбоев. (C) результаты и нагрузки сравнения между необработанной управления (красный) и ферментативно-деградированные (синий и зеленый) эластичных волокон в родной ткани. Рисунок 4. HART's окрашенных листовки аортального клапана свиньи. Эластичные волокна визуализируются в черный цвет. (А) и (Б) показывают, необработанных контроля и (C) и (D) изображают образцы тканей, которые подвергались эластина, разрушающих ферментов эластазы в течение 30 минут. Спектральный в см -1 </strong> Назначение 12 717-719 CN Фосфолипиды 785-788 ДНК / РНК базы, ПГС позвоночник ДНК / РНК 1003 – 1005 Фенилаланин Белок 1220-1280 Амид III Белок 1445-1447 CH 2 Белки / Липидный 1655-1680 Амид IC = C Белки липидного Таблица 1. Полос КР, которые были обнаружены в спектрах всех типах клеток (фибробласты, МСК, хондроциты и кератиноцитов).