ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

1。生体試料の調製生きた細胞の調製付着細胞の調製ガラスボトムディッシュ（グライナーBioOne /ドイツ）、37でそれらをインキュベートに関する in vitro培養または新たに単離された細胞のシード℃、5％CO 2の細胞接着が完了するまで。 培地を除去し、PBS、測定の前で穏やかに3回洗浄します。全体の測定手順を通してPBSまたは細胞培養培地のいずれかで覆われた細胞を保持します。 懸濁液中の細胞の調製一般的なプロトコル（例えば、トリプシン-EDTA、細胞スクレイピング）に従ってin vitroで培養細胞中で切断し、細胞を遠心分離し、得られたPBSで細胞ペレットまたは細胞培養培地に再懸濁する。 ガラスボトムディッシュに：細胞懸濁液100μl（最大100,000細胞/ mlの濃度）を転送します。 NATの準備IVEの組織組織を収穫した後、4℃または氷上測定前に12時間以上滅菌、氷冷PBSに移し、もはやそれらを保つません。以前の実験では、長期保管時間（4℃冷虚血時間は> 12時間）、自然分解プロセスによるスペクトルの変化をもたらしたことを示している。 測定は、組織の乾燥に起因するECMタンパク質や細胞の損傷を避けるためにPBSで覆われた組織または媒体で実行する必要があります。 2。ラマン分光計私達のカスタマイズされたラマン分光は、ラマンスペクトルを持つ明視野および蛍光画像の直接比較を可能にするラマン分光で標準的な蛍光顕微鏡（Olympus IX 71）を兼ね備えています。基本セットは、最大784 nmのダイオードレーザー（TopticaフォトニクスAG /ドイツ）、励起光からのラマン散乱光を分離するためのノッチフィルタ、顕微鏡で構成されていますスペクトル情報（ソフトイメージングシステム/ドイツからF-ビュー）の検出に最適化された電荷結合素子（CCDカメラ）とND分光器（カイザーオプティカルシステムズ、アナーバー/アメリカ）。 3。レーザー機能の制御ソフトウェアアンドールソリス（アンドール/イギリス）を起動して、°Cカメラの熱誘起電流によるノイズを最小限に抑えるために-60 CCDカメラの温度を設定します。 キャリブレーション手順については、顕微鏡ステージ上にシリコンウエハを配置します。 上にレーザーをオンにし、85 mWまでのパワーを設定します。 XYが表示されるまで、ウェハ上にレーザーの焦点を合わせるために、ソフトウェアセルB（オリンパス/ドイツ）を使用します。 60倍の空気対物レンズを用いて1秒の単一の積分時間で、シリコンウェーハを測定します。 画素数からアンドールソリスソフトウェアのラマンシフト（cm -1）を、x軸の単位を変更します。 の520 cm -1にシリコンピークのレーザーの焦点を変えるこのラマンバンドのために最大限の強度を見つけるためにスペクトルを収集。カウントの最小量は、キャリブレーションの成功を持っている11000以上でなければなりません。 4。ラマン分光測定すべての測定は室温で行われます。 基本的な設定サンプルのスペクトルを収集するために1.2の開口数で60倍の水浸対物レンズ（オリンパス/ドイツ）を使用します。 測定は100秒の合計10の統合/ 10秒に取得の設定を変更します。 付着細胞の測定細胞をガラス底皿を取り、顕微鏡ステージ上に置きます。 優れた信号を取得し、再現性を確保するために、細胞核にレーザーの焦点を、顕微鏡の光をオフにし、スペクトルの収集を開始します。 背景電子の参照スペクトルを測定セルの横にレーザーフォーカスを移動することにより、非常に10スペクトルを示す。それは、フォーカスを変更したときに新しい背景がそれぞれの焦点深度のために収集する必要があることを考慮することが重要です。 懸濁液中の細胞の測定ガラスボトムディッシュに細胞懸濁液の100μlを移し、顕微鏡ステージ上に置きます。 セルの中心にレーザーの焦点を、顕微鏡の光をオフにし、スペクトルの収集を開始します。 セルの横にレーザーフォーカスを移動することによって、バックグラウンドの参照スペクトルすべての10のスペクトルを測定します。フォーカスを変更する場合は、新しいバックグラウンドは新しいフォーカスの深さのために収集する必要があります。 ネイティブの組織の測定サンプルを取り、ガラス底皿に置きます。関心領域（ROI）は、皿の底に直面して配向されるべきである。 サンプルをカバーするのに十分なPBSで皿を記入してください。 任意の楽章を避けるために、サンプル上のカバーガラスを置き測定中にサンプルのement。 興味のある構造（深さ分解能はレーザーや組織に依存します）にレーザーの焦点を設定し、スペクトルの収集を開始します。 全体の組織領域のレーザー外にフォーカスを移動することにより、バックグラウンドの参照スペクトルすべての10のスペクトルを収集します。フォーカスを変更する場合は、新しいバックグラウンドは新しいフォーカスの深さのために収集する必要があります。 免疫蛍光の測定（IF）で標識した凍結切片標準cryotomを使用してセクション新鮮、スナップ凍結組織サンプルとシリカ被覆カバーガラス上にマウントします。 短い固定ステップ（4％パラホルムアルデヒドで最大10分）を用い、目的のタンパク質を検出するための適切な抗体を用いて、IFのルーチンプロトコルに従って凍結切片を染色する。 蛍光が発生する領域で焦点ラマン測定を行う。 エラスチンの分解実験ナンプラーCEガラス底皿の底に面した解剖ブタの大動脈弁尖（エラスチンが豊富な、心臓弁尖の血液流入側の層）のventricularis。 線維構造に焦点を当て、全体の組織表面を横切って30のランダムな点で "非インキュベートしたコントロールなどのネイティブ組織を測定します。 3つのセクションにサンプルを分割し、エラスターゼ溶液（5 U / mlと、ワージントン/ドイツ）の2ミリリットルを充填した独立した2.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに入れます。 37℃で15または30分のいずれかに組織をインキュベートします。 15または30分間インキュベートした後、エッペンドルフチュー​​ブから組織を除去し、完全に酵素反応を止めるためにPBSで丁寧に洗い流してください。 線維構造に焦点を当て、30のランダムな点で、各サンプルを測定します。 5。データ処理と解析ラマンスペクトルの処理の前処理生成されたスペクトルは、OPUSソフトウェア（ブルカーオプティック社/ドイツ）を用いて行った。 測定時の焦点の変化による変動を避けるために、ガラスやメディアなどからの干渉信号を低減するために、収集したスペクトルから対応するバックグラウンドスペクトルを減算します。 情報の最大量を提供しています400〜1800センチメートル-1の波数領域にスペクトルを減らすことができます。 必要に応じて、最大ピークスペクトルを正規化します。サンプルのスペクトルの構造変化の検出を簡素化強度の変動と系統の故障、外正規化因子。 異なる実験間の比較可能性を高めるために、ベースライン補正を行います。 ラマンスペクトルの解析ラマンスペクトルは、Unscrambler（CAMO /ノルウェー）のソフトウェアとPCAを用いて分析した。この多変量解析は、スペクトルデータ内の類似点と相違点を検出セット。すべてのスペクトルは、すべてのラマンシフトのために収集されたカウントに基づいて、多次元空間内の単一の点としてプロットされます。各主成分（PC）は、元のデータに含まれる全情報の一定量を示しています。最初のPCは、バリエーションの最高のソースを含むものである。次の各PCは、順番に、以前のものより少ない情報が含まれています。すべての変数は、スコアと各PCの負荷を持っています。パソコン（=スコア）をプロットすることにより、重要なサンプルの相関が露出することができます。負荷は、PCAの各分析変数の寄与を説明します。 すべてのサンプルグループの行の範囲を作成することによって、測定値の各グループにラベルを付けます。 PCAは、以下の基本的な設定を使用します。クロスバリデーション、NIPALSアルゴリズム、回転させないし、分析を開始します。これらの設定は、スペクトルに依存しています。 PCAを実行します。 6。代表的な結果ラマンSPectraは、しばしば低信号対雑音比と低全体的な信号強度（ 図1）を明らかにした接着細胞から生成された。レーザーの焦点は、ガラス底の近くに設定する必要がありますという事実のために11は、干渉の影響をガラス信号は、実際のサンプル信号のマスキングを引き起こして、かなり高いです。その後のバックグラウンド減算中にその結果、サンプル信号が最小化されるかもしれない、あるいは排除した。したがって、我々は、彼らがより詳細なスペクトル情報の検出を可能として、我々のラマン分光分析のために懸濁液中で細胞を使用することを好む。しかし、付着および浮遊細胞のスペクトルはその強度のみが異なる同一の主ピークを示す。 サスペンション内の異なる種類の細胞の特性については、全く前処理は必要ありません。懸濁液中で測定したヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞（MSC）、軟骨細胞およびケラチノサイトの平均ラマンスペクトルと標準偏差である図2に示す。すべてのラマンスペクトルは、同様に（ 表1参照）のピークがそのようなタンパク質、核酸、脂質などの典型的な生体分子に由来すると、構造化されています。これらの細胞型は12、600、1800 cm -1の間のスペクトル領域にすることにより、最も関連性のスペクトル情報が含まれていますその明確な違いは、異なる種類の細胞（ 図2A）との間で検出可能である。典型的な、我々は、コラーゲンと脂質の分子振動に割り当てることが明確な構造の違いを表示1スペクトル領域（1280〜1350センチメートル-1）を 、強調した。対照的に、形態素解析は、ほとんどの細胞の同定および区別（ 図2B-I）には適していません。軟骨細胞や皮膚細胞の間に差がある（ 図2D、H対B、FとE、I）観測されていますが、線維芽細胞とMSCは単に明るいフィールドmicrsocを使用して分離することは困難であるOPY（ 図2B、F対C、G）13 特にECMタンパク質のネイティブ組織のラマン分光分析では、ROIは、それぞれの構造に焦点を当てることができるようにするために明視野イメージングにより可視化することができている必要があります。特定の指紋スペクトルへのタンパク質の割り当てについては、我々は市販の純粋なタンパク質と免疫組織染色した切片のラマンスペクトルを生成します。ここでは、凍結乾燥したエラスチン、エラスチンに対する抗体を用いる免疫蛍光染色した切片を比較して、ネイティブの組織内の弾性線維の指紋スペクトルを同定した。しかし、エラスチンは、ラマンスペクトルに反映されて高い蛍光を備えているので、、データ解析は困難である（ 図3A）。により、そのような蛍光等の試料固有のプロパティに体系的障害を軽減するために、データ·セットの適切な処理が重要である。私たちのデータでalyses、我々は純粋なエラスチンタンパク質の有意に高い信号強度を排除するために正規化を使用し、従って、我々は同等のラマンスペクトル（ 図3B）を生成することができました。エラスチンは、体の中で最も安定したECMタンパク質の一つであるため、低下させることは非常に困難である14私たちの実験的なセットアップでは、酵素消化を行うことにより、健康なブタ大動脈弁尖にエラスチンの分解を誘導した。多変量解析主成分分析を適用して、我々は、酵素処理したサンプルとネイティブコントロール（ 図3C）のラマンスペクトルの間に有意差を同定した。これらのスペクトルの違いは、861、1003と1664センチメートル-1でローディングスペクトルで観察された。エラスターゼに拡張された露光時間に起因するエラスチン含有繊維で期待される構造変化は、より明確な分離スコアクラスタに反映されたHARTの染色（ 図4）、（図3C）によって示された。 図1：戸建てとの接着線維芽細胞のラマンスペクトルを意味します。 図2（A）のラマンスペクトルと、4つの異なる主要な単離された細胞型（線維芽細胞、MSCは、軟骨細胞とケラチノサイト）の標準偏差を意味します。構造的な違いは-1 1350センチメートル-フレームは1280のスペクトル領域を強調表示します。戸建（B）の線維芽細胞（BE）の明視野像、（C）MSCは、（D）軟骨細胞および（E）ケラチノサイト。スケールバーは20μmに相当します。付着性（F）の線維芽細胞（FI）明視野像、（G）MSCは、（H）軟骨細胞および（I）ケラチノサイト。スケールバーは200μmに相当します。 図3。lyophiliの正規化せずに（A）のラマンスペクトルZEDエラスチン（青線）、免疫蛍光法（IF）で標識した凍結切片（オレンジライン）とネイティブ大動脈弁尖の中で測定した弾性線維（赤線）。凍結乾燥したエラスチンの高信号強度は蛍光によって引き起こされます。 （B）正規化後のラマンスペクトル全身の障害を排除するため。 （C）スコアおよび非処理コントロール（赤）と酵素的に分解し（青、緑）ネイティブ組織内の弾性線維の間の比較の負荷。 図4。HART's染色ブタの大動脈弁尖。弾性線維は黒で表示されている。 （A）と（B）非処理対照と（C）を示し、（D）30分間エラスチン分解酵素エラスターゼにさらされた組織サンプルを表しています。 cm -1で波数 </strong> 割り当て12 717から719 CN リン脂質 785から788 DNA / RNAの塩基、 OPOのバックボーン DNA / RNA 1003 – 1005 フェニルアラニンタンパク質 1220-1280 アミドIII タンパク質 1445-1447 CH 2 タンパク質/脂質 1655-1680 アミドIC = C タンパク質の脂質 表1。すべての種類の細胞（線維芽細胞、MSCは、軟骨細胞とケラチノサイト）のスペクトル内で検出されたラマンバンド。