Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

1. Biyolojik Numune Hazırlanması Yaşayan hücrelerin hazırlanması Yapışmış olan hücrelerin hazırlanması Cam bir alt çanak (Greiner BioOne / Almanya) ve 37 bunları tasarlamak üzerine in vitro-kültür veya taze izole hücrelerinde Tohum ° C ve% 5 CO 2 hücre eki tamamlanana kadar. Kültür ortamı çıkartın ve PBS önce ölçümü ile yavaşça üç kere yıkayın. Bütün ölçüm işlemi boyunca PBS veya hücre kültür aracı ya kaplı hücreleri tutmak. Süspansiyon hücrelerin hazırlanması Ortak bir protokol (örn. tripsin-EDTA, hücre kazıma) 'ye göre vitro-kültürlenmiş hücrelerde ayırmak, hücreler santrifüj edilir ve elde edilen PBS içerisinde hücre peleti veya hücre kültür ortamı yeniden askıya. Bir cam alt çanak için: hücre süspansiyonu 100 ul (max 100.000 hücre / ml. Konsantrasyon) aktarın. Nat hazırlanmasıive dokuların Dokuların hasat edildikten sonra, 4 ° C'de veya buz önce ölçümü 12 saatten daha steril, buz gibi soğuk PBS aktarmak ve artık onları tutun. Önceki deneyler uzun bir depolama süresi (4 ° C'de soğuk iskemi zamanı> 12 saat) doğal bozunma süreçleri nedeniyle spektral değişikliklere sebep olduğunu göstermiştir. Ölçümler doku kurutma sonucu ECM proteinleri ve hücre hasarı önlemek için PBS veya orta kaplı doku ile gerçekleştirilmesi gerekir. 2. Raman Spektrometresi Bizim özel Raman spektroskopisi Raman parlak alan ve floresan görüntülerin doğrudan karşılaştırma sağlayan bir Raman spektrometresi ile standart bir floresan mikroskop (Olympus IX 71) birleştirir. Temel set up 784 nm diyot laser (Toptica fotonik AG / Almanya), eksitasyon ışıktan Raman-dağınık ışık ayrılması için bir çentik filtresi, bir mikroskop, bir oluşurnd bir spektral bilgi (Yumuşak Görüntüleme Sistemleri / Almanya F-görüntülemek) tespiti için optimize edilmiş bir şarj bağlı cihaz (CCD kamera) ile spektrograf (Kaiser Optik Sistemleri A.Ş., Ann Arbor / Amerika). 3. Lazer Fonksiyon Kontrolü Yazılım Andor Solis (Andor / Birleşik Krallık) başlatın ve -60 CCD kamera sıcaklığını ayarlamak ° C kamera ısının neden akımların neden olduğu gürültüyü en aza indirmek için. Kalibrasyon işlemi için mikroskop sahnede bir silikon yerleştirin. Üzerine lazer açın ve gücü 85 mW ayarlanır. XY görünene kadar gofret üzerine lazer odaklanmak için yazılım Hücre B (Olympus / Almanya) kullanın. Bir 60x hava objektif kullanarak 1 sn tek bir entegrasyon süresi ile silikon ölçün. Piksel sayısından Andor Solis yazılım Raman shift (cm -1) x-ekseninin birimini değiştirin. 520 cm -1 silikon tepe lazer odak VaryBu Raman bandı için mümkün olan maksimum yoğunluğu bulmak için spektrum toplanır. Sayıları minimum tutar başarılı bir kalibrasyon için 11.000 'den yüksek olmalıdır. 4. Raman Spektroskopik Ölçümler Tüm ölçümler oda sıcaklığında yapılır. Temel ayarlar Örneklerin spektrum toplamak için 1.2 sayısal bir diyafram ile 60x suya daldırma nesnel (Olympus / Almanya) kullanın. Ölçümleri başına 100 saniye olmak üzere toplam 10 entegrasyonlar / 10 saniye satın ayarlarını değiştirin. Yapışkan hücreler ölçümü Hücreleri ile cam alt çanak alın ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Daha iyi bir sinyal almak ve tekrarlanabilirliği sağlamak, hücre çekirdeğinin üzerine lazer odaklanmak için, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. Arka e bir referans spektrumu ölçünHücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek çok 10 spektrumları. Bu odak değiştirirken yeni bir arka plan her odak derinliği için toplanan gerektiğini dikkate almak önemlidir. Süspansiyon hücreleri Ölçümü Cam alt kabına hücre süspansiyonu 100 ul aktarın ve mikroskop sahneye yerleştirin. Hücrenin merkezinde lazer odaklanın, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. Hücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları ölçün. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. Yerli dokuların Ölçümü Örnek al ve cam bir alt tabak içine yerleştirin. Faiz getirisi (ROI) bölgesi tabağın tabanına dönük odaklı olmalıdır. Örnek karşılamak için yeterli PBS ile çanak doldurun. Herhangi mov önlemek için numune üzerinde cam bir kapakla yerleştirinölçümler sırasında numunenin ement. Faiz yapısına lazer odağı ayarlayın (derinlik çözünürlüğü lazer ve doku bağımlı) ve spektrumları toplamaya başlar. Bütün doku alanının lazer dışarı odaklanmak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları toplayın. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. Immünfloresan ölçümü (IF) etiketli cryosections Standart bir cryotom ve silis kaplı kapak gözlük takar kullanarak Bölüm taze, ek dondurulmuş doku örnekleri. Sadece kısa bir fiksasyon adım (% 4 paraformaldehit ile en fazla 10 dakika) istihdam ve faiz protein tespiti için uygun antikorları kullanarak, IF için rutin bir protokolü takip cryosections Leke. Floresans meydana alanda odaklanarak Raman ölçümleri gerçekleştirin. Elastin bozulması deneyler Place cam alt tabağın tabanına dönük disseke domuz aort kapakçık (elastin açısından zengin, kalp kapak broşürün kan akışını tarafı katmanı) ventricularis. Fibril yapıları odaklanarak bütün doku yüzeyi boyunca 30 rastgele noktalarda bir 'non-İnkübe kontrolü' olarak doğal dokuya ölçün. 3 bölüme örnek bölün ve bir elastaz çözüm (5 U / ml, Worthington / Almanya) 2 ml ile dolu ayrı 2,5 ml Eppendorf tüpler içine koyun. 37, 15 ya da 30 dakika ya için doku inkübe ° C. 15 ya da 30 dakika inkübasyondan sonra ya için, Eppendorf tüpüne gelen doku kaldırmak ve tamamen enzimatik reaksiyonu durdurmak için PBS ile dikkatle yıkanır. Fibril yapıları odaklanarak, 30 rastgele noktalarda her bir örnek ölçün. 5.. Veri İşleme ve Analizi Raman işleme Bir ön-muameleoluşturulan spektrumları OPUS yazılım (Bruker Optik GmbH / Almanya) kullanılarak yapıldı. Ölçümler sırasında odak değişikliklere neden olduğu farklılıklar önlemek için cam ve orta yanı sıra ile müdahale sinyalleri azaltmak amacıyla, alınan spektrumları karşılık gelen arka tayfı çıkarılır. Bilgi en yüksek miktar sunuyor 400-1800 cm -1 arasında wavenumber bölgeye spektrumları azaltın. Gerekirse, maksimum pik için spektrumları normalleştirmek. Örnek spektrumu yapısal değişikliklerin saptanması basitleştirilmesi yoğunluk dalgalanmaları ve sistematik arızaları, dışarı Normalizasyon faktörler. Farklı deneyler arasındaki karşılaştırılabilirlik artırmak için temel bir düzeltme yapın. Raman analizi Raman Unscrambler (CAMO / Norveç) yazılımı ile PCA kullanılarak analiz edildi. Bu değişkenli analizde spektral verilerin içinde benzerlik ve farklılıkları algılarsetleri. Her spektrum her Raman vardiya toplanan sayıları dayalı çok boyutlu bir uzayda tek bir nokta olarak çizilir. Her bir temel bileşen (PC), orijinal veri içerdiği toplam bilgi belli bir miktar açıklanmaktadır. Birinci bilgisayar varyasyon yüksek kaynağı içeren biridir. Her aşağıdaki PC, sırayla, bir öncekine göre daha az bilgi içerir. Her değişkenin her PC'de bir puan ve bir yükleme var. PC'ler (= puan) çizerek, önemli bir örnek korelasyon gösterilebilir. Yüklemeler PCA her analiz değişkenin katkıları açıklayınız. Her örneklem grubu için satır aralıkları oluşturarak ölçümler her grup etiketleyin. PCA için aşağıdaki temel ayarları kullanın: çapraz doğrulama, NIPALS algoritması, hiçbir rotasyon ve analizi başlatın. Bu ayarlar spektrumları bağlıdır. PCA gerçekleştirin. 6. Temsilcisi Sonuçlar Raman spyapışık hücrelerinden oluşturulan ectra genellikle düşük sinyal-gürültü oranı ve düşük bir genel sinyal yoğunluğu (Şekil 1) lazer odak cam altında, müdahale etkisi yakın duzenlenmeli olması nedeniyle. 11 ortaya cam sinyali gerçek örnek sinyal maskeleme neden oldukça yüksektir. Bir sonraki geri çıkarma sırasında Bu nedenle, örneğin sinyal minimize olabilir veya hatta ortadan kaldırılmıştır. Onlar daha detaylı spektral bilgi algılanmasına izin olarak Böylece, biz, bizim Raman spektroskopik analiz için süspansiyon hücreleri kullanmayı tercih eder. Bununla birlikte, yapışık ve süspansiyon hücreleri spektrumları, sadece kendi yoğunluklarındaki farklı aynı temel zirveleri sergilerler. Bir süspansiyon içinde farklı hücre tiplerinin karakterizasyonu için, herhangi bir ön-muamele gereklidir. Süspansiyon ölçülen ortalama Raman ve insan fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler (MKH), kondrosit ve keratinositlerin standart sapma olarakŞekil 2 içinde gösterildiği. Bütün Raman benzer zirveleri (bkz. Tablo 1) protein, nükleik asit ve lipidler gibi tipik biyomoleküllerin menşeyli, yapılandırılmıştır. Bu hücre türleri için 12, 600 ve 1800 cm -1 en ilgili spektral bilgi içeren arasındaki spektral bölgede tarafından hangi belirgin farklılıklar farklı hücre tipleri (Şekil 2A) arasında algılanabilen edilir. Örnek, biz kollajen ve lipid moleküler titreşimler atanabilir olduğunu açıkça yapısal farklılıklar sergileyen bir spektral bölgede (1280-1350 cm -1) vurgulanır. Buna karşılık, morfolojik analizler çoğu hücrelerin tanımlanması ve ayrım (Şekil 2B-I) için uygun değildir. Kondrosit ve cilt hücreleri arasındaki fark (Şekil 2B, H karşı B, F ve E, I) gözlemlenebilir edilirken, fibroblast ve MKH sadece parlak alan micrsoc kullanarak ayırmak zorduropyala (Şek. 2B, F karşılık C, G). 13 Özellikle ECM proteinleri doğal dokuya, Raman spektroskopik analizi ROI ilgili yapısına odaklanmak edebilmek için, parlak alan görüntüleme ile görülebilmesi gerektirir. Belirli bir parmak izi spektrumu için bir proteinin atama için, piyasada bulunan saf protein ve immunohistologically lekeli cryosections arasında Raman oluşturulur. Burada, liyofilize elastin ve elastin karşı bir antikor istihdam immünfloresan lekeli cryosections karşılaştıran doğal dokuların içinde elastik liflerin parmak izi spektrumları belirledi. Elastin Raman yansıyan bir yüksek otofloresansı, özellikleri beri Ancak, veri analizi (Şekil 3A) zordur. Nedeniyle bu tür otofloresansı, veri kümelerinin uygun bir işleme gibi örnek özgü özellikleri sistematik başarısızlığı azaltmak için önemlidir. Bizim veriler biralyses, biz saf elastin protein anlamlı olarak daha yüksek sinyal yoğunluğu ortadan kaldırmak için normalleşme kullanılır ve bu nedenle, biz (Şekil 3B) karşılaştırılabilir Raman oluşturmak başardık. Elastin vücutta en istikrarlı ECM ​​proteinleri biridir ve aşağılamak için bu nedenle çok zordur. Bizim deneysel set up yılında 14, biz bir enzimatik sindirimi gerçekleştirerek sağlıklı domuz aort kapakçık elastin bozulmaya bağlı. Çok değişkenli analiz PCA uygulamak, biz enzimatik tedavi edilen örnekleri ve yerel denetimleri (Şekil 3C) ve Raman arasında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. Bu spektral farklar 861, 1003 ve 1664 cm -1 yükleme spektrumda gözlendi. Elastaz için uzun pozlama süreleri nedeniyle elastin lifleri içeren Beklenen yapısal değişiklikler de daha belirgin ayrılabilir skoru kümeler yansıdı HART Kullanıcı boyama (Şekil 4), (Şekil 3C) tarafından gösterildi. Şekil 1. Müstakil ve yapışık fibroblastların Raman ortalama. Şekil 2. (A) Raman ve dört farklı ilköğretim izole hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) ve standart sapmalar. Yapısal farklılıklar ile 1350 cm -1 – çerçeve 1280 spektral bölgede vurgulamaktadır. Müstakil (B) fibroblast (BE) Parlak alan görüntüleri, (C) MKH, (D) kondrosit ve (E) keratinositler. Ölçek bar 20 mikron eşittir. Yapışık (F) fibroblast (FI) Parlak alan görüntüleri, (G) MKH, (H) kondrosit ve (I) keratinositler. Ölçek bar 200 mikron eşittir. Şekil 3. Lyophili normalleşme olmadan (A) Ramanzed elastin (mavi çizgi), immünofloresan (IF) etiketli cryosections (turuncu çizgi) ve nativ aort kapakçık içinde ölçülen elastik lifler (kırmızı çizgi). Liyofilize elastin yüksek sinyal yoğunluğu otofloresans kaynaklanır. Normalleştirme sonrası (B) Raman sistemik hataları ortadan kaldırmak için. (C) skorları ve arıtılmamış kontrolü (kırmızı) ve enzimatik-bozulmuş (mavi ve yeşil) doğal doku içinde elastik lifler arasında karşılaştırma yükleri. Şekil 4. HART's lekeli domuz aort kapakçık. Elastik lifler siyah canlandırırlar. (A) ve (B) arıtılmamış kontrolü ve (C) ve (D) 30 dakika boyunca elastin-bozundurucu enzimi elastaz maruz bırakıldı doku örnekleri tasvir göstermektedir. Cm -1 wavenumber </strong> Atama 12 717-719 CN Fosfolipidler 785-788 DNA / RNA bazları, OPO omurgası DNA / RNA 1003 – 1005 Fenilalanin Protein 1220-1280 Amid III Protein 1445-1447 CH2 Protein / Lipid 1655-1680 Amid IC = C Protein Lipid Tablo 1. Bütün hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) spektrumu içinde algılanır Raman bantları.