Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

1. Preparação da amostra biológica Preparação de células vivas Preparação de células aderentes Sementes em células in vitro-cultivados ou recentemente isolado sobre um prato de fundo de vidro (Greiner BioOne / Alemanha) e incubar-los a 37 ° C e 5% de CO 2 até ligação de células é concluída. Remover o meio de cultura e lavar suavemente três vezes com PBS antes de medição. Manter as células cobertas com PBS ou meio de cultura celular em todo o procedimento de medição todo. Preparação das células em suspensão Retire in vitro em cultura de células de acordo com protocolos comuns (por exemplo, tripsina-EDTA, raspagem célula), centrifugar as células e re-suspender o sedimento celular obtido em PBS ou meio de cultura celular. Transferir 100 uL da suspensão de células (concentração: max. 100.000 células / ml) para um prato de fundo de vidro. Preparação de native tecidos Após a colheita dos tecidos, transferi-los para estéril, PBS gelado e mantê-los não mais do que 12 horas a 4 ° C, ou por medição gelo antes. As experiências anteriores demonstram que um tempo de armazenamento prolongado (tempo de isquemia fria de 12 horas a 4 ° C) resultou em alterações espectrais devido aos processos de degradação naturais. As medições devem ser realizadas com o tecido coberto em PBS ou meio para evitar danos das proteínas de ECM e células devido a secagem dos tecidos. 2. Raman Spectrometer O nosso espectrómetro de Raman personalizado combina um microscópio de fluorescência padrão (Olympus IX 71) com um espectrómetro de Raman, que permite a comparação directa das imagens de campo brilhante e fluorescência com os espectros de Raman. O conjunto de base até consiste de um 784 nm diodo laser (Toptica fotónica AG / Alemanha), um filtro de entalhe para a separação da luz Raman-dispersa a partir da luz de excitação, um microscópio umand a. espectrógrafo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / EUA) com um dispositivo de carga acoplado (CCD da câmera) otimizado para a detecção de informação espectral (F-vista do Soft Systems imagem / Alemanha) 3. Controle da Função Laser Inicie o software Andor Solis (Andor / Reino Unido) e ajustar a temperatura da câmara CCD a -60 ° C para minimizar o ruído causado pelas correntes termicamente induzidas na câmara. Colocar uma bolacha de silício sobre a platina do microscópio para o procedimento de calibração. Ligar o laser e definir o poder de 85 mW. Use o software Célula B (Olympus / Alemanha) para focalizar o laser sobre a bolacha até parece XY. Medir a bolacha de silício com um tempo de integração única de 1 seg usando um objectivo ar 60x. Alterar a unidade do eixo-x a partir do número de pixels para mudança de Raman (cm -1) no software Solis Andor. Variar o foco do laser do pico de silício a 520 cm -1 emo espectro recolhido a fim de encontrar a intensidade máxima possível para esta banda Raman. A quantidade mínima de contagens deve ser superior a 11.000 para ter uma calibração bem sucedida. 4. Raman medições espectroscópicas Todas as medições são realizadas à temperatura ambiente. As definições básicas Usar uma objectiva de imersão em água 60x (Olympus / Alemanha) com uma abertura numérica de 1,2 para recolher o espectro das amostras. Alterar as configurações de aquisição a 10 integrações / 10 segundos para um total de 100 segundos por medições. Medição de células aderentes Pegue o prato com fundo de vidro com as células e colocá-lo no palco microscópio. A fim de obter um melhor sinal e garantir a reprodutibilidade, foco do laser sobre o núcleo da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro. Meça um espectro de referência do fundo emuito espectros 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. É importante considerar que ao mudar o foco um novo fundo devem ser recolhidos para cada profundidade de foco. Medição de células em suspensão Transferir 100 uL da suspensão de células numa cápsula de fundo de vidro e colocá-la na platina do microscópio. Foco do laser sobre o centro da célula, transformar a luz do microscópio fora e iniciar a recolha do espectro. Meça um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10, movendo o foco do laser ao lado da célula. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco. Medição dos tecidos nativas Leve a amostra e colocá-lo em um prato fundo de vidro. A região de interesse (RDI) devem ser orientados de frente para o fundo do prato. Encha o prato com PBS suficiente para cobrir a amostra. Coloque um vidro de cobertura sobre a amostra para evitar qualquer movement da amostra durante as medições. Definir o foco do laser na estrutura de interesse (resolução de profundidade é a laser e tecido-dependente) e começar a recolher os espectros. Recolher um espectro de referência do fundo todos os espectros de 10 movendo-se o laser de se concentrar para fora da área do tecido todo. Ao mudar o foco, um novo fundo devem ser recolhidos para a profundidade novo foco. Medição de imunofluorescência (IF)-rotulados criossecções Seção fresco, congelado amostras de tecido usando um cryotom padrão e montá-los em vidros de sílica revestidos de cobertura. Manchar os criossecções seguindo um protocolo de rotina para IF, empregando apenas um passo de fixação curto (máximo 10 minutos, com paraformaldeído a 4%) e utilizando anticorpos adequados para a detecção da proteína de interesse. Realizar medições Raman centrados na área onde ocorre a fluorescência. Degradação experimentos elastina Place o ventricularis dos dissecados folhetos aórticos porcinos válvula (elastina-rico, a camada de sangue influxo lado do folheto da válvula cardíaca) voltados para o fundo do prato de fundo de vidro. Medir o tecido nativo como um 'de controlo não-incubada' menos 30 pontos aleatórios em toda a superfície do tecido todo focagem nas estruturas fibrilares. Dividir a amostra em 3 secções e colocá-los em separados 2,5 tubos Eppendorf ml cheios com 2 ml de uma solução de elastase (5 U / ml, Worthington / Alemanha). Incubar o tecido para 15 ou 30 minutos a 37 ° C. Após incubação durante 15 ou 30 minutos, remover os tecidos a partir do tubo de Eppendorf e lavar cuidadosamente com PBS, a fim de parar completamente a reacção enzimática. Meça cada amostra em 30 pontos aleatórios, concentrando-se nas estruturas fibrilares. 5. Processamento de Dados e Análise Processamento de espectros Raman O pré-tratamento doOs espectros de gerado foi realizada usando software OPUS (Bruker Optik GmbH / Alemanha). A fim de reduzir sinais de interferência a partir do vidro e médio bem como para evitar variações provocadas por alterações no foco durante as medições, subtrair o espectro de fundo correspondente a partir dos espectros recolhidos. Reduzir o espectro para a região número de onda entre 400-1800 cm -1, que oferece a maior quantidade de informações. Se necessário, normalizar os espectros para o pico máximo. Fatores de normalização fora das flutuações de intensidade e falhas sistemáticas, simplificando a detecção de mudanças estruturais no espectro da amostra. Realizar uma correção de linha de base para aumentar a comparabilidade entre diferentes experimentos. Análise dos espectros Raman Os espectros Raman foram analisados ​​utilizando PCA com o software Unscrambler (CAMO / Noruega). Esta análise multivariada detecta diferenças e semelhanças nos dados espectraisconjuntos. Cada espectro é plotado como um ponto único em um espaço multidimensional com base nas contagens coletados para cada turno Raman. Cada componente de princípio (PC) descreve uma certa quantidade, o total de informação contida nos dados originais. O primeiro PC é a que contém a maior fonte de variação. Cada PC a seguir contém, na ordem, menos informação do que o anterior. Cada variável tem uma pontuação e uma carga em cada PC. Ao traçar PCs (= pontos), correlações importantes amostras podem ser expostos. As cargas descrever a contribuição de cada variável analisada para o PCA. Rotular cada grupo de medidas, criando faixas de linha para cada grupo de amostra. Utilize as seguintes definições básicas para o PCA: validação cruzada, o algoritmo NIPALS, sem rotação e iniciar a análise. Essas configurações são espectros dependente. Execute o PCA. 6. Os resultados representativos Raman spECTRA gerada a partir de células aderentes revelam frequentemente uma relação sinal-ruído baixo e uma intensidade de sinal global baixo (Fig. 1). 11 Devido ao facto de que o foco do laser tem de ser definido perto do fundo do vidro, a influência da interferindo sinal de vidro é bastante elevado, causando mascaramento do sinal de amostra real. Por conseguinte, o sinal da amostra pode ser minimizada ou eliminada, mesmo durante um subsequente fundo subtracção. Assim, nós preferimos usar células em suspensão para a nossa análise espectroscópica de Raman, uma vez que permitem a detecção de uma informação mais detalhada espectral. No entanto, os espectros de células aderentes e suspensão exibem os mesmos picos principais diferindo apenas nas suas intensidades. Para a caracterização de tipos de células diferentes dentro de uma suspensão, sem pré-tratamento é necessário. Os espectros de Raman média e desvio padrão de fibroblastos humanos, células estaminais mesenquimais (MSCs), condrócitos e queratinócitos medido em suspensão sãorepresentado na Figura 2. Todos os espectros de Raman são similarmente estruturado, com picos proveniente de biomoléculas típicos, tais como proteínas, ácidos nucleicos e lípidos (ver Tabela 1). 12 Para estes tipos de células, a região espectral entre 600 e 1800 cm -1 contém mais relevante informação espectral, por qual as diferenças claras são detectáveis ​​entre os diferentes tipos de células (Fig. 2A). Exemplar, destacamos uma região espectral (1280-1350 cm -1) apresentando claras diferenças estruturais, que pode ser atribuído às vibrações moleculares de colágeno e lipídios. Em contraste, as alterações morfológicas não são adequados para a identificação e distinção da maioria das células (Fig. 2B-I). Embora a diferença entre os condrócitos e células da pele é observável (Fig. 2D, H versus B, F e E, I), os fibroblastos e os MSCs são difíceis de separar usando unicamente de campo brilhante micrsocopiar (Fig. 2B, F versus C, G). 13 Análise espectroscópica de Raman do tecido nativo, particularmente das proteínas da MEC, requer que um ROI pode ser visualizado por brilhante-campo de imagem, a fim de ser capaz de se concentrar na respectiva estrutura. Para a atribuição de uma proteína a um espectro de impressão digital específica, geramos espectros Raman de proteínas disponíveis comercialmente puros e criosecções immunohistologically manchadas. Aqui, identificamos os espectros de impressões digitais das fibras elásticas em tecidos nativos comparando elastina liofilizado e imunofluorescência manchadas criosecções empregando um anticorpo contra elastina. No entanto, uma vez que a elastina possui uma autofluorescência elevada, o que se reflecte no espectro de Raman, a análise dos dados é um desafio (Fig. 3A). Para reduzir o fracasso sistemático devido à amostra propriedades específicas, tais como, autofluorescência um processamento adequado dos conjuntos de dados é crucial. Em nossos dados de umalyses, utilizou-se a normalização para eliminar a intensidade do sinal significativamente mais elevado da proteína pura de elastina, e assim, fomos capazes de gerar espectros de Raman comparável (Fig. 3B). A elastina é uma das proteínas de ECM mais estáveis ​​do corpo e é, portanto, muito difícil de se degradar. 14 No nosso conjunto experimental acima, nós induzida degradação da elastina em saudáveis ​​suína folhetos da válvula aórtica através da realização de uma digestão enzimática. Aplicando a análise multivariada PCA, identificou-se diferenças significativas entre os espectros de Raman do enzimaticamente tratados com as amostras e controlos nativas (Fig. 3C). Estas diferenças espectrais foram observados no espectro de carregamento em 861, 1003 e 1664 cm1. Esperados alterações estruturais nas fibras de elastina contendo devido aos tempos de exposição prolongados para elastase foram mostradas através de coloração de Hart (Fig. 4), que foram também se reflecte no mais grupos distintos de pontuação separáveis ​​(Fig. 3C). Figura 1. A média de espectros Raman de fibroblastos destacados e aderente. Figura 2. (A) A média de espectros Raman e desvios-padrão de quatro diferentes tipos de células isoladas primárias (fibroblastos, células mesenquimais, condrócitos e queratinócitos). A armação destaca a região espectral de 1280 – 1350 cm1 com diferenças estruturais. (BE) de campo brilhante imagens de geminadas (B) fibroblastos, (C) MSCs, (D) condrócitos e (E) queratinócitos. Barra de escala é igual a 20 microns. (FI) de campo brilhante imagens de aderentes (F) fibroblastos, (G) MSCs, (H) e condrócitos i) queratinócitos. Barra de escala é igual a 200 mM. Figura 3. (A) Os espectros de Raman sem normalização da lyophilized elastina (linha azul), imunofluorescência (IF)-rotulados criosecções (linha laranja) e fibras elásticas (linha vermelha) medidos dentro folhetos da válvula aórtica nativa. A intensidade de sinal de alta da elastina liofilizado é causada por autofluorescência. (B) Os espectros de Raman após a normalização, a fim de eliminar falhas sistémicas. (C) Resultados e cargas da comparação entre controle não-tratado (vermelho) e enzimaticamente degradado (azul e verde) elásticas fibras dentro do tecido nativo. Figura 4. HART's manchadas de suínos folhetos da válvula aórtica. As fibras elásticas são visualizados em preto. (A) e (B) mostram controle não-tratado e (C) e (D) mostram amostras de tecido que foram expostos a enzima elastase elastina-degradantes para 30 minutos. Número de onda em cm -1 </strong> Atribuição de 12 717-719 CN Fosfolipídios 785-788 ADN / ARN bases, Backbone OPO DNA / RNA 1003 – 1005 Fenilalanina Proteína 1220-1280 III amida Proteína 1445-1447 CH 2 Proteína / lípido 1655-1680 Amida IC = C Lipídeos Tabela 1. Bandas Raman que são detectados dentro de espectros de todos os tipos de células (fibroblastos, MSCs, condrócitos e queratinócitos).