ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן
Summary
ספקטרוסקופיית ראמאן היא טכניקה מתאימה ללא מגע, תווית ללא ניתוח של תאים חיים, רקמות מהונדסות בונה רקמות מקומיות. מקור ספציפיים טביעות אצבעות ספקטרלית ניתן להפיק נותחו באמצעות ניתוח רב משתני.
Abstract
טכנולוגיות שאינו הרסני, ללא מגע ו תווית ללא לפקח על תאים בתרביות רקמה יש צורך בתחום של מחקר ביו. 1-5 שיטות שגרתיות עם זאת, זמין כרגע לדרוש צעדים עיבוד ולשנות שלמות המדגם. ספקטרוסקופיית ראמאן היא שיטה מהירה, המאפשרת מדידה של דגימות ביולוגיות ללא צורך צעדים עיבוד נוסף. . זו טכנולוגיה מבוססת לייזר מזהה פיזור קשיח של אור מונוכרומטי 6 כמו בכל רעידות כימי מוקצה הלהקה ראמאן ספציפי (wavenumber ב -1 ס"מ), כל דגימה ביולוגית כולל דפוס ספקטרלי טיפוסי בשל הרכב ביוכימי הטבוע בהם 7. – 9 בתוך ספקטרום ראמאן, את עוצמות השיא לתאם עם כמות את הקשרים המולקולאריים הנוכחי. 1 נקודות דמיון ושוני של ערכות נתונים ספקטרליים ניתן לאתר על ידי שימוש בניתוח רב משתני (קרן למשל רכיב ניתוח (PCA)). 10 </sup>
כאן, אנו מבצעים ספקטרוסקופיית ראמאן של תאים חיים ורקמות מקומיים. תאים זרע או על מנות התחתונה זכוכית או שמרו על ההשעיה בתנאים נורמליים התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לפני המדידה. רקמות הילידים הם גזור ומאוחסנים פוספט בופר סליין (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס מדידות קודמות. בהתאם קבוצת הניסוי שלנו, אנחנו מכן התמקדה גם על גרעין התא או תאית (ECM) מטריקס חלבונים כגון קולגן ואלסטין ו. עבור כל המחקרים, מינימום של 30 תאים או 30 נקודות אקראיות של עניין בתוך ECM נמדדים. מדרגות עיבוד נתונים כלל רקע חיסור ונורמליזציה.
Protocol
Discussion
ספקטרוסקופיית ראמאן היא כלי מתאים לנתח דגימות ביולוגיות, כמו במבחנה, בתרבית תאים וחלבונים ECM, כמו גם תאים בתוך רקמות מקומיות. 11,15,16 הנה, הראינו כי זה ללא מגע, ללא תווית הטכניקה מאפשרת אפליה של סוגי תאים שונים, זיהוי של פירוק חלבונים ECM מבוססת אך ורק על הרכב biomolecular הפנימי של אלה דגימות ביולוגיות.
היתרון הגדול של ספקטרוסקופיית ראמאן היא היכולת הלא פולשני לכמת את טביעת האצבע ביוכימי של מדגם של ספקטרום ראמאן שהתקבל שלה. בניגוד ספקטרוסקופית אינפרא אדום, אשר מניב מידע דומה, ספקטרום ראמאן ניתן לאסוף דגימות מימית, כמו פיזור ראמאן מן המים חלש. בנוסף, ספקטרוסקופיית ראמאן מבוססת על זיהוי של backscattering של אור מונוכרומטי, ולכן לא נדרש עיבוד מדגם המדידה הקודמת. תכונות אלו הופכות את ראספקטרוסקופיה אדם אלטרנטיבה מבטיח פוטנציאל יישומי הדמיה ב vivo. לגבי זה, ספקטרוסקופיה קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (מכוניות) היא טכניקה מאוד מעניינת מכיוון שהיא מאפשרת מהר רכישת רגיש יותר של נתונים המבוססים על אותם אותות הרטט מנוצל בניסויים שלנו. 15,16 שיטות חלופיות אחרות, לרבות autofluorescence multiphoton הנגרמת ואת הדור השני הדמיה הרמונית הוכחו בעבר להיות מתאים ניטור פולשני דגימות ביולוגיות שאינן או מינימלית. 17 עם זאת, אלו שיטות הדמיה קשורים עלויות גבוהות מאוד מוגבלים autofluorescence להפקת מולקולות. בנוסף, ספקטרומטר ראמאן קל לשלב עם מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. תכונות אלו הופכות את ספקטרוסקופיית ראמאן כלי רב ערך כדי ללמוד דגימות ביולוגיות בסביבות פיזיולוגיים.
אחת המגבלות הנוכחיות של ספקטרוסקופיית ראמאן שלנו היא להקיםמוקד לייזר קטן יחסית (250 ננומטר רוחב 1/2 לכל היותר (FWHM) לרוחב ו 700 ננומטר FWHM צירית), אשר נוצר על ידי המטרה צמצם גבוהה המספרי (NA = 1.2). אמנם צמצם המספרי גבוה מאפשר לכסות כמות טובה של האור הנפלט ראמאן מניב יחס אות לרעש גבוה, NA גבוהה מייצרת רק המיקוד אוסף קטן בתוך מדגם זה הוא בדרך כלל הרבה יותר קטן מאשר בתא. על מנת להשוות ספקטרום ראמאן של תאים שונים, אוסף של הספקטרום נציג חיוני, וזה קשה להשיג עם אזור המיקוד קטן. כדי לטפל בבעיה זו, אנו עובדים על התהליך כדי להפוך את האוסף האות בנקודות שונות בתוך התא (= מיפוי ספקטרוסקופיות ראמאן), וכתוצאה מכך רפאים בממוצע וכנוע למגוון מייצג. בנוסף, טכניקה זו תספק סקירה של חלוקת להקות ראמאן ספציפיים, למשל חלוקת חלבונים בתוך התא.
Biolדגימות ogical הם מורכבים מאוד מורכב מתערובת הטרוגנית של ביומולקולות התורמים ספקטרום ראמאן אסף. לכן, דפוס ספקטרלי הוא מורכב מאוד את הפיקוח על סוג אחד של מולקולות בתוך ספקטרום ראמאן קשה להשיג עם חפיפה של אותות מולקולות שונות. בנוסף, הקרינה הפנימית של מדגם יכול להסתיר מידע בעל ערך של אותות ראמאן החלשות. מעניין לציין, כי בכמה מחקרים קודמים שלנו, זיהינו autofluorescence בספקטרום ראמאן כגורם מבדל העיקרי בין סוגי תאים (MSCs ו fibroblasts) באמצעות כלי הניתוח המתאים. 13 זיהינו גם שינויים בעוצמת האות הכולל ראמאן יכול לשמש אינדיקטור למצב של קולגן סיבי קולגן בתוך ECM של עלונים שסתום אבי העורקים. 9 עם זאת, כאשר מנתחים את מצב ואלסטין ברקמות אלה, לא הצליחו לזהות תוצאות דומות. כאמור בתוצאהבסעיף זה, היינו רק מסוגל לזהות שינויים של להקות ראמאן ספציפיים של elastase שטופלו דגימות בהשוואה לקבוצת הביקורת מקומיים. לא ראינו ירידה של האות ראמאן הכוללת את enzymatically שטופלו דגימות כצפוי. תצפיות אלו הביאו עלילה ציון כי לא חשף את היווצרות אשכול ברור כפי שניתן לראות במחקר הקודם. 9 לעומת זאת, ההשפעה של טיפול אנזימטי לא הורגש בתוך תוצאות PCA. אנו מניחים כי אלה פערים בין שני החלבונים ECM, וכן קולגן ואלסטין, מבוססים על הבדלים מורפולוגיים שונים ותהליכים השפלה אנזימטיות: בתוך העלון שסתום אבי העורקים, קולגן עשיר אזור (fibrosa) היא שכבה רציפה שהופך משוחרר עקב טיפול אנזימטי, לפיה ואלסטין המכיל אזור (ventricularis) יש תצורת הרשת המופיע מקוטעת לאחר חשיפה elastase (איור 4). מדידות ספוט יחיד ולכן לא היו המתאימהאכלו כדי לאתר קרעים קטנים כאלה בתוך הרשת ואלסטין. כאן, מיפוי ראמאן של רקמת יעזור לזהות תקלות ברשת.
אתגר נוסף ספקטרוסקופיית ראמאן של דגימות ביולוגיות היא להפחית את זמני המדידה. פתרון אחד הוא להגדיל את כוח לייזר, אשר מתאים כל עוד דגימות ביולוגיות אינם מושפעים נזק תמונה. כל הניסויים הנוכחיים שלנו הם הוכחה של עקרון מחקרים המתמקדים במחקר בסיסי, עם זאת, המטרה הכללית שלנו היא ליישם ספקטרוסקופיית ראמאן עבור יישומים קליניים, כולל רפואה רגנרטיבית (למשל בקרת איכות של רקמות מהונדסות מוצרים), לפני השתלת ניטור שוחד אבחון סרטן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סטפן קוך לעזרה טכנית שלו שאנון לי Layland (הן IGB פראונהופר בשטוטגרט) עבור הצעות מועילות על כתב היד שלו. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי תוכנית למשוך את של Fraunhofer-Gesellschaft ו BMBF (הן KS-L.).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| elastase | Worthington | LS006363 | |
| anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
| The Unscrambler | CAMO | ||
| Opus | Bruker |
References
- Chan, J. W., Lieu, D. K. Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy. J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).
- Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).
- Gentleman, E. Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation. Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).
- Notingher, I., Hench, L. L. Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro. Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).
- Schenke-Layland, K. Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability. Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 122, 12 (1928).
- Frushour, B. G., Koenig, J. L. Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin. Biopolymers. 14, 379-391 (1975).
- Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants. Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).
- Votteler, M. Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues. J. Biophotonics. , (2011).
- Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. Principal component analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).
- Pudlas, M. Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells. Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. . Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).
- Pudlas, M. Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy. Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).
- Mecham, R. P. Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification. Methods. 45, 32-41 (2008).
- Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives. Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).
- Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues. Analyst. 134, 1046-1057 (2009).
- Schenke-Layland, K. Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures. J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).
