Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

1. Preparazione del campione biologico Preparazione delle cellule viventi Preparazione delle cellule aderenti Seme in cellule coltivate in vitro, o isolate di fresco su un piatto di vetro inferiore (Greiner BioOne / Germania) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino attaccamento cellulare è completata. Togliere terreno di coltura e lavare delicatamente tre volte con PBS misura preventiva. Conservare le cellule coperti sia con PBS o terreno di coltura cellulare durante tutta la procedura di misura. Preparazione delle cellule in sospensione Staccare in vitro-colture di cellule in base a protocolli comuni (ad esempio, tripsina-EDTA, scraping cella), centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare ottenuta in PBS o terreno di coltura cellulare. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare (concentrazione: massimo 100.000 cellule / ml) ad un piatto fondo di vetro. Preparazione di native tessuti Dopo la raccolta i tessuti, trasferirli sterile, ghiacciato PBS e tenerli non più di 12 ore a 4 ° C oppure attraverso una misurazione ghiaccio prima. Esperimenti precedenti hanno dimostrato che un tempo prolungato stoccaggio (tempo di ischemia fredda> 12 ore a 4 ° C) determinato cambiamenti spettrali dovute a processi di degradazione naturali. Le misurazioni devono essere effettuate con il tessuto rivestito in PBS o mezzo per evitare danneggiamenti delle proteine ​​ECM e le cellule a causa di asciugatura del tessuto. 2. Spettrometro Raman Il nostro spettrometro Raman personalizzata combina un microscopio a fluorescenza standard (Olympus IX 71), con uno spettrometro Raman che permette il confronto diretto delle immagini in campo chiaro e fluorescenza con gli spettri Raman. Il set di base è costituito da un diodo laser 784 nm (AG Toptica fotonica / Germania), un filtro notch per la separazione del Raman-luce diffusa dalla luce di eccitazione, un microscopio unond uno spettrografo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) con un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) ottimizzato per la rilevazione di informazioni spettrali (F-view from soft Imaging Systems / Germania). 3. Controllo della funzione Laser Avviare il software Andor Solis (Andor / Regno Unito) e impostare la temperatura della camera CCD a -60 ° C per ridurre al minimo il rumore provocato dalle correnti indotte termicamente nella fotocamera. Posizionare un wafer di silicio sul palco microscopio per la procedura di calibrazione. Accendere il laser e impostare la potenza a 85 mW. Utilizzare il software delle cellule B (Olympus / Germania) di focalizzare il laser sul wafer fino XY appare. Misurare il wafer di silicio con un unico tempo di integrazione di 1 sec usando un obiettivo 60x aria. Modificare l'unità della x-asse da alla variazione del numero di pixel Raman (cm -1) nel software Andor Solis. Variare il fuoco del laser al silicio del picco a 520 cm -1 inil raccolto spettro per trovare l'intensità massima possibile per questa banda Raman. La quantità minima di conteggi deve essere maggiore di 11.000 a una riuscita della calibrazione. 4. Raman misure spettroscopiche Tutte le misure sono eseguite a temperatura ambiente. Impostazioni di base Utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua 60x (Olympus / Germania) con un'apertura numerica di 1,2 per raccogliere lo spettro dei campioni. Modificare le impostazioni di acquisizione integrazioni a 10/10 secondi per un totale di 100 secondi per le misurazioni. Misurazione di cellule aderenti Prendete il piatto fondo di vetro con le celle e collocarlo sul palco microscopio. Per ottenere un segnale migliore e garantire la riproducibilità, focalizzare il laser sul nucleo della cellula, ruotare la luce microscopio e iniziare la raccolta dello spettro. Misurare uno spettro di riferimento del fondo emolto 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cella. E 'importante considerare che quando si cambia la messa a fuoco un nuovo sfondo devono essere raccolti per ogni profondità di messa a fuoco. Misurazione di cellule in sospensione Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare nel piatto inferiore vetro e posizionarlo sul microscopio scena. Fuoco del laser al centro della cella, ruotare la luce microscopio e iniziare la raccolta dello spettro. Misurare uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cella. Quando si cambia la messa a fuoco, un nuovo sfondo devono essere rilevati per la profondità nuova attenzione. Misurazione di tessuti nativi Prendete il campione e trasferirli in un piatto fondo di vetro. La regione di interesse (ROI) dovrebbero essere orientati verso il fondo del recipiente. Riempire il piatto con PBS a sufficienza per coprire il campione. Posizionare un bicchiere di copertura sul campione per evitare qualsiasi movement del campione durante le misurazioni. Impostare il fuoco del laser nella struttura di interesse (risoluzione in profondità è laser e tessuto-dipendente) e iniziare a raccogliere gli spettri. Raccogliere uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il laser fuoco all'esterno della zona di tessuto intero. Quando si cambia la messa a fuoco, un nuovo sfondo devono essere rilevati per la profondità nuova attenzione. Misura di immunofluorescenza (IF)-etichettati criosezioni Sezione freschi, congelati snap-campioni di tessuto utilizzando un cryotom standard e li montano su silice rivestite con vetri di copertura. Colorare le criosezioni secondo un protocollo di routine per IF, impiegando soltanto un piccolo passo di fissaggio (max 10 minuti con paraformaldeide al 4%) e utilizzando anticorpi appropriati per la rilevazione della proteina di interesse. Eseguire misurazioni Raman concentrandosi nella zona in cui si verifica fluorescenza. Elastina degradazione esperimenti Place la ventricularis dei lembi della valvola aortica dissezionati suina (elastina ricco, sangue afflusso strato di lato del lembo della valvola cardiaca) di fronte al fondo del piatto inferiore vetro. Misurare il tessuto nativo come un 'non-incubate control' a 30 punti casuali in tutta la superficie del tessuto intera messa a fuoco nelle strutture fibrillari. Dividere in 3 sezioni e inserirli in separati 2.5 ml provette Eppendorf contenenti 2 ml di una soluzione elastasi (5 U / ml, Worthington / Germania). Incubare il tessuto per 15 o 30 minuti a 37 ° C. Dopo incubazione per 15 o 30 minuti, rimuovere i tessuti dalla provetta Eppendorf e lavare accuratamente con PBS al fine di interrompere completamente la reazione enzimatica. Misurare ogni campione a 30 punti casuali, concentrandosi nelle strutture fibrillari. 5. Elaborazione dati e analisi Spettri Raman di elaborazione Il pre-trattamento deispettri generati è stata eseguita utilizzando il software OPUS (Bruker Optik GmbH / Germania). Al fine di ridurre i segnali interferenti dal vetro e mezzo, nonché per evitare variazioni dovute variazioni del fuoco durante le misure, sottrarre lo spettro corrispondente sfondo dal spettri raccolti. Ridurre gli spettri nella regione tra il numero d'onda 400-1800 cm -1, che offre la più alta quantità di informazioni. Se necessario, normalizzare gli spettri al picco massimo. Fattori di normalizzazione indica le fluttuazioni di intensità e fallimenti sistematici, semplificando l'individuazione di cambiamenti strutturali nello spettro del campione. Eseguire una correzione al basale per aumentare la comparabilità tra i diversi esperimenti. Analisi di spettri Raman Gli spettri Raman sono stati analizzati utilizzando PCA con la (CAMO / Norvegia) software Unscrambler. L'analisi multivariata rileva le differenze e le somiglianze all'interno dei dati spettraliset. Ogni spettro è tracciata come un unico punto in uno spazio multidimensionale in base ai conteggi raccolti per ogni turno Raman. Ciascun componente principale (PC) descrive una certa quantità di informazioni totale contenute nei dati originali. Il primo PC è quello che contiene la prima fonte di variabilità. Ogni PC che segue contiene, in ordine, meno informazioni rispetto al precedente. Ogni variabile ha un punteggio e un caricamento su ogni PC. Tracciando PC (= punteggi), correlazioni campione importanti possono essere esposti. I caricamenti descrivono il contributo di ciascuna variabile analizzata per la PCA. Etichettare ogni gruppo di misure con la creazione di campi di riga per ogni gruppo di campioni. Utilizzare le seguenti impostazioni di base per la PCA: cross di convalida, l'algoritmo NIPALS, nessuna rotazione e avviare l'analisi. Queste impostazioni sono spettri dipendenti. Eseguire la PCA. 6. Risultati rappresentativi Raman spECTRA generata da cellule aderenti spesso rivelano un basso rapporto segnale-rumore e una bassa intensità di segnale globale (Fig. 1). causa del fatto che il fuoco del laser deve essere impostata in prossimità del fondo di vetro, l'influenza del interferire 11 segnale bicchiere è piuttosto elevata, provocando mascheramento del segnale campione effettivo. Di conseguenza, il segnale campione potrebbe essere ridotta o addirittura eliminato durante una successiva sottrazione del fondo. Così, si preferisce utilizzare cellule in sospensione per la nostra analisi spettroscopica Raman, in quanto consentono il rilevamento di informazioni più dettagliate spettrale. Tuttavia, gli spettri di cellule aderenti e le sospensioni presentano le stesse vette principali che differiscono solo nella loro intensità. Per la caratterizzazione di tipi cellulari diversi all'interno di una sospensione, senza pre-trattamento è richiesto. Gli spettri Raman media e la deviazione standard di fibroblasti umani, cellule staminali mesenchimali (MSC), condrociti e cheratinociti misurato in sospensione sonoillustrato nella figura 2. Tutti gli spettri Raman sono strutturati in modo simile, con picchi provenienti da biomolecole tipici quali proteine, acidi nucleici e lipidi (vedi Tabella 1). 12 Per questi tipi di cellule, la regione spettrale fra 600 e 1800 cm -1 contiene più pertinenti informazione spettrale, da chiare differenze che sono individuabili tra i differenti tipi di cellule (Fig. 2A). Esemplare, abbiamo evidenziato una regione spettrale (1280-1350 cm -1) presentano chiari differenze strutturali, che è assegnabile a vibrazioni molecolari di collagene e di lipidi. Al contrario, le analisi morfologiche non sono adatti per l'identificazione e la distinzione delle maggior parte delle cellule (Fig. 2B-I). Mentre la differenza tra condrociti e cellule della pelle è osservabile (Fig. 2D, H contro B, E e F, I), fibroblasti e MSC sono difficili da separare utilizzando esclusivamente in campo chiaro micrsocopia (Fig. 2B, F rispetto a C, G) 13. Raman analisi spettroscopica di tessuto nativo, in particolare di proteine ​​ECM, richiede che una ROI può essere visualizzato in campo chiaro immagini per essere in grado di concentrarsi sulla rispettiva struttura. Per l'assegnazione di una proteina di uno spettro impronta specifica, abbiamo generato spettri Raman di proteine ​​pure disponibili in commercio e criosezioni immunoistologico macchiati. Qui, abbiamo individuato gli spettri delle impronte digitali di fibre elastiche all'interno dei tessuti nativi confronto elastina liofilizzato e immunofluorescenza macchiati criosezioni che impiegano un anticorpo contro l'elastina. Tuttavia, poiché elastina presenta un autofluorescenza alto, che si riflette nella spettri Raman, l'analisi dei dati è impegnativo (Fig. 3A). Per ridurre l'errore sistematico dovuto campione proprietà specifiche, come autofluorescenza, un trattamento adeguato dei set di dati è fondamentale. In uno i nostri datialyses, abbiamo utilizzato la normalizzazione per eliminare l'intensità del segnale significativamente maggiore della proteina pura elastina, e quindi, siamo stati in grado di generare comparabile spettri Raman (fig. 3B). L'elastina è una delle proteine ​​ECM più stabili nel corpo ed è quindi molto difficile da degradare 14. Nel nostro set up sperimentale, abbiamo indotto la degradazione elastina in volantini sani suina della valvola aortica eseguendo una digestione enzimatica. Applicando la analisi multivariata PCA, abbiamo individuato differenze significative tra gli spettri Raman di enzimaticamente trattati con campioni ed i controlli nativi (Fig. 3C). Queste differenze sono state osservate spettrali nello spettro di carico a 861, 1003 e 1664 cm -1. Attesi cambiamenti strutturali nelle fibre a causa di tempi di esposizione prolungati a elastasi elastina contenenti sono stati mostrati mediante colorazione HART (Fig. 4), che sono riflesse anche in più gruppi distinti punteggio separabili (Fig. 3C). Figura 1. Media spettri Raman dei fibroblasti staccati e aderente. Figura 2. (A) media spettri Raman e deviazioni standard di quattro differenti tipi principali di cellule isolate (fibroblasti, CSM, condrociti e cheratinociti). Il telaio mette in evidenza la regione spettrale di 1280 – 1350 cm -1 con le differenze strutturali. (BE) in campo chiaro immagini di staccate (B), i fibroblasti (C) MSCS, (D) e condrociti (E) cheratinociti. Barra della scala è uguale a 20 micron. (FI) in campo chiaro immagini di aderenti (F), i fibroblasti (G) MSC, (H) e (i condrociti) cheratinociti. Barra della scala equivale a 200 micron. Figura 3. (A) spettri Raman senza normalizzazione di lyophiliZed elastina (linea blu), immunofluorescenza (IF)-etichettati criosezioni (linea arancione) e le fibre elastiche (linea rossa) misurati all'interno lembi della valvola aortica nativa. L'intensità di segnale alto liofilizzata elastina è causato da autofluorescenza. (B) spettri Raman dopo la normalizzazione per eliminare guasti sistemici. (C) I punteggi ed i caricamenti del confronto tra i non-trattata di controllo (rosso) e-enzimaticamente degradata (blu e verde) fibre elastiche nel tessuto nativo. Figura 4. HART's macchiati suina lembi valvolari aortici. Le fibre elastiche sono visualizzati in nero. (A) e (B) mostrano non trattati e di controllo (C) e (D) rappresentano campioni di tessuto che sono stati esposti alla elastina-enzima degradante elastasi per 30 minuti. Numero d'onda in cm -1 </strong> Assegnazione 12 717-719 CN Fosfolipidi 785-788 DNA / RNA basi, OPO backbone DNA / RNA 1003 – 1005 Fenilalanina Proteina 1220-1280 Ammide III Proteina 1445-1447 CH 2 Proteine ​​/ lipidi 1655-1680 Amide IC = C Protein lipidi Tabella 1. Bande Raman che vengono rilevati in spettri di tutti i tipi cellulari (fibroblasti, CSM, condrociti e cheratinociti).