عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان
Summary
رامان الطيفي هو تقنية مناسبة للاتصال غير، تسمية خالية من تحليل الخلايا الحية، بنيات الأنسجة المهندسة وأنسجة الأم. مصدر محدد يمكن أن تتولد البصمات الطيفية وتحليلها باستخدام التحليل متعدد المتغيرات.
Abstract
وهناك حاجة إلى تقنيات غير مدمرة، وعدم الاتصال والتسمية خالية من رصد الخلايا والأنسجة الثقافات في مجال البحوث الطبية الحيوية. 1-5 الأساليب الروتينية ولكن المتاحة حاليا تتطلب خطوات تجهيز وتغير سلامة العينة. رامان الطيفي هو وسيلة سريعة تمكن من قياس العينات البيولوجية من دون الحاجة لاتخاذ خطوات مزيد من المعالجة. . هذه التكنولوجيا ليزر مقرها بالكشف عن نثر غير مرن للضوء أحادي اللون 6 كما تم تعيين كل اهتزاز الكيميائية إلى الفرقة رامان محددة (متجه مموج موجه في سم -1)، كل عينة بيولوجية تحتوي على نمط نموذجي الطيفية نظرا لتركيبتها الكيميائية الحيوية الكامنة 7 – 9 ضمن أطياف رامان، وشدة ذروة ترتبط كمية من السندات الجزيئية الحالي. ويمكن الكشف عن 1 أوجه التشابه والاختلاف من مجموعات البيانات الطيفية من خلال استخدام التحليل المتعدد المتغيرات (مثل تحليل المكون الرئيسي (PCA)) 10 </suP>
هنا، ونحن أداء رامان الطيفي من الخلايا الحية والأنسجة الأصلية. والمصنف إما الخلايا على أطباق أسفل الزجاج أو الاحتفاظ بها في تعليق تحت ظروف طبيعية ثقافة خلية (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2) قبل القياس. يتم تشريح الأنسجة الأصلية وتخزينها في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في تمام الساعة 4 قياسات درجة مئوية قبل. اعتمادا على مجموعة تجريبية لدينا، فنحن ثم تركز إما على نواة الخلية أو خارج الخلية المصفوفة (ECM) البروتينات مثل الإيلاستين والكولاجين. لجميع الدراسات، ويتم قياس لا يقل عن 30 خلايا أو 30 نقطة عشوائية من الاهتمام داخل ECM. وشملت البيانات خطوات معالجة الخلفية الطرح والتطبيع.
Protocol
Discussion
رامان الطيفي هو أداة مناسبة لتحليل العينات البيولوجية، مثل في المختبر، مثقف الخلايا والبروتينات ECM وكذلك خلايا داخل أنسجة الأم. 11،15،16 هنا، أثبتنا أن هذا الاتصال غير، والتسمية خالية من تقنية تسمح لل تمييز أنواع مختلفة من الخلايا والكشف عن تدهور البروتين ECM التي تستند فقط على تكوين الجزيئية البيولوجية لا يتجزأ من هذه العينات البيولوجية.
والميزة الرئيسية لرامان التحليل الطيفي هو القدرة على غير جراحية تحديد البصمة الحيوية لعينة من أطياف رامان الناتجة لها. وعلى النقيض من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء، التي تعطي معلومات مماثلة، ويمكن جمع أطياف رامان من العينات المائية، كما تبعثر رامان من المياه ضعيفة. وبالإضافة إلى ذلك، يستند فقط رامان الطيفي على الكشف عن ارتداد مبعثر من ضوء أحادي اللون، وبالتالي، لم يكن يحتاج إلى تجهيز العينات قبل القياس. هذه الصفات تجعل رعالتحليل الطيفي رجل بديلا واعدا لإمكانية في تطبيقات التصوير الحي. في هذا الإطار، متماسك رامان الطيفي المضادة للستوكس (السيارات) هي تقنية مثيرة للاهتمام للغاية نظرا لأنه يتيح أسرع واكتساب أكثر حساسية من البيانات استنادا إلى إشارات الذبذبات نفسه الاستفادة منها في تجاربنا. 15،16 طرق بديلة أخرى بما في ذلك multiphoton بفعل تألق ذاتي وتم التصوير 2 جيل متناسق ثبت سابقا أن تكون مناسبة لرصد العينات البيولوجية جراحية غير أو أدنى (17). ومع ذلك، وترتبط هذه الطرائق التصوير مع التكاليف المرتفعة جدا وتقتصر على تألق ذاتي لتوليد الجزيئات. وبالإضافة إلى ذلك، مطياف رامان من السهل أن تتحد مع المجاهر البصرية التقليدية. هذه الخصائص تجعل رامان الطيفي أداة قيمة لدراسة العينات البيولوجية في البيئة الفسيولوجية.
تعيين واحد من القيود الحالية المفروضة على التحليل الطيفي لدينا هو ما يصل رامانالتركيز ليزر صغير نسبيا (250 نانومتر نصف عرض كامل كحد أقصى (FWHM) الوحشي و 700 نانومتر محوري FWHM) التي يتم إنشاؤها بواسطة هدف الفتحة العددية عالية (NA = 1.2). وعلى الرغم من ارتفاع الفتحة العددية يسمح لتغطية كمية لا بأس بها من الضوء المنبعث رامان الرضوخ في نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية، وارتفاع NA لا تنتج سوى التركيز مجموعة صغيرة داخل العينة التي عادة ما يكون أصغر بكثير من خلية. من أجل المقارنة بين أطياف رامان من الخلايا المختلفة، وجمع طائفة وممثل أمر ضروري، والتي يصعب الحصول عليها مع التركيز منطقة صغيرة. لمعالجة هذه المسألة، ونحن نعمل على عملية لأتمتة جمع إشارة عند نقاط مختلفة داخل الخلية (= رسم الخرائط الطيفية رامان)، مما أدى إلى الطيفية في المتوسط، والرضوخ لطيف وممثل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه التقنية توفر لمحة عامة عن توزيع الفرق رامان محددة، على سبيل المثال لتوزيع البروتينات داخل الخلية.
بيولعينات ogical معقدة للغاية، وتتألف من خليط غير متجانس من الجزيئات الحيوية التي تساهم في أطياف رامان والتي تم جمعها. ولذلك، فإن نمط طيفية معقدة إلى حد كبير، ورصد من نوع واحد من جزيء داخل الطيف رامان من الصعب تحقيقه مع تداخل الاشارات جزيء مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، قد مضان الذاتية للعينة يخفي معلومات قيمة من الإشارات الضعيفة رامان. ومن المثير للاهتمام، في بعض دراساتنا السابقة، حددنا تألق ذاتي في أطياف رامان هو العامل الرئيسي الذي يفرق بين أنواع الخلايا (MSCS والخلايا الليفية) باستخدام أداة التحليل المناسبة. 13 تعرفنا أيضا أن التغيرات في كثافة إشارة رامان عموما يمكن أن تكون بمثابة مؤشرا لحالة الكولاجين وألياف الكولاجين داخل ECM منشورات صمام الشريان الأبهر. 9 ومع ذلك، كنا عند تحليل حالة الإيلاستين في هذه الأنسجة، وليس قادرا على الكشف عن نتائج مماثلة. كما ورد في النتيجةق الباب، كنا فقط قادرة على الكشف عن التعديلات من عصابات رامان محددة في عينات إيلاستاز المعالجة بالمقارنة مع الضوابط الوطنية. لم نكن نرى انخفاضا من الإشارة رامان العام في عينات إنزيمي المعالجة كما هو متوقع. أدت هذه الملاحظات في مؤامرة النقاط التي لم يكشف عن تشكيل كتلة واضح كما رأينا في الدراسة السابقة. (9) وفي المقابل، فإن تأثير المعالجة الأنزيمية كان من الممكن اكتشاف ضمن نتائج اتفاقية الشراكة والتعاون. نحن نفترض أن تقوم هذه التناقضات بين البروتينات ECM اثنين، والإيلاستين والكولاجين، وعلى الاختلافات الشكلية ومختلف عمليات تدهور الأنزيمية: ضمن نشرة صمام الشريان الأبهر، والمنطقة غنية الكولاجين (ليفي) هو طبقة المستمر الذي يصبح خففت نتيجة لل علاج الأنزيمية، حيث الإيلاستين التي تحتوي على منطقة (البطين) يحتوي على تكوين شبكة الاتصال الذي يظهر بعد التعرض للتجزئة إيلاستاز (الشكل 4). وكانت القياسات بقعة واحدة ولذلك لا اعتماداتأكلت لاكتشاف تصدعات صغيرة من هذا القبيل ضمن شبكة الإيلاستين. هنا، فإن تعيين رامان من النسيج يساعد في تحديد أعطال الشبكة.
وثمة تحد آخر في رامان التحليل الطيفي للعينات البيولوجية للحد من الأوقات قياس. حل واحد هو زيادة قوة الليزر، الذي هو مناسبة طالما لا تتأثر العينات البيولوجية بواسطة ضرر الصورة. كل من تجاربنا الحالية هي إثبات صحة المبدأ الدراسات التي تركز على البحوث الأساسية، ولكن هدفنا العام هو تنفيذ رامان التحليل الطيفي للتطبيقات السريرية بما في ذلك الطب التجديدي (مثل مراقبة الجودة من الأنسجة المهندسة المنتجات)، قبل زرع مراقبة الكسب غير المشروع و سرطان التشخيص.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ستيفن كوتش على دعمه التقني وشانون لي Layland (سواء فراونهوفر مجلس الحبوب العراقي شتوتغارت) على اقتراحاته مفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل برنامج جذب للفراونهوفر غزلشافت وBMBF ل(على حد سواء إلى KS-L).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| elastase | Worthington | LS006363 | |
| anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
| The Unscrambler | CAMO | ||
| Opus | Bruker |
References
- Chan, J. W., Lieu, D. K. Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy. J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).
- Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).
- Gentleman, E. Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation. Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).
- Notingher, I., Hench, L. L. Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro. Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).
- Schenke-Layland, K. Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability. Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 122, 12 (1928).
- Frushour, B. G., Koenig, J. L. Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin. Biopolymers. 14, 379-391 (1975).
- Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants. Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).
- Votteler, M. Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues. J. Biophotonics. , (2011).
- Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. Principal component analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).
- Pudlas, M. Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells. Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. . Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).
- Pudlas, M. Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy. Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).
- Mecham, R. P. Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification. Methods. 45, 32-41 (2008).
- Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives. Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).
- Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues. Analyst. 134, 1046-1057 (2009).
- Schenke-Layland, K. Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures. J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).
