Использование фармакологических-вызов МРТ в доклинических исследований: Приложение к 5-HT системы

Подготовка животных в естественных МРТ 1. Хирургическая катетеризация Обезболить крыс (самцов крыс линии Вистар, 200-300 г) с ИФ (5% индукции, а затем уменьшить до 1,5-2% для поддержания анестезии во время подготовки животных и сканирование), приведенным в медицинских воздуха (21% O 2, BOC Великобритания) . Убедитесь, что животное хорошо анестезии и не проявляет ответ на ноги шнура. Бедренной артерии и вены канюлю для газов крови и измерение артериального давления и введения препарата проблемой соответственно. Во время хирургической процедуры, температура тела животного контролируется и поддерживается с помощью ректального датчика и тепловой одеяло (Harvard аппарат). Наркоза животное находится на потепление площадку под микроскопом вскрытии в лежачее положение спины. Бритье середины бедра и области кожи тампоном со спиртом. Сделайте 2 см разрез кожи вдоль складки образуются на брюшной полости и правого бедра.Тупое рассечение приводящей мышцы используется для визуализации бедренной артерии, вены и бедренного нерва. Отделите тщательно сосудов. Аккуратно связать шелковой лигатуры полностью вокруг дистального конца сосуда и поместить другую связь с половины хирургических узлов свободно в проксимальных сайта. Применение тяги как лигатуры, чтобы закупорить кровоток в оставшейся части середине судна подвергаются между лигатуры. Сделайте небольшой надрез около 1/3 судна окружности в этой части судна, чтобы вставки ПЭ-50 канюля (0,54 мм и внутренним диаметром 0.96mm по наружному диаметру в случае взрослых крыс-самцов, в противном случае 0,40 мм и ID 0,80 мм ED) в сосуд. Канюли должны быть вставлены несколько мм (по крайней мере, 5) в сосуд. Как только в просвет, промойте небольшим количеством гепаринизированной солевой (15 UI / мл) через сосуд, чтобы избежать образования тромбов. Проксимальный цикл шелка и лигировали полностью исправить канюли. REPEAT эту процедуру для второго судна. Клей кожу с помощью клея Vetbond тканей (3M Великобритании PLC, Bracknell, Великобритания), когда обе канюли на месте. См. рисунок 1 для точного размещения канюли. Поместите животных в MR совместимы кровать стереотаксической (m2m изображений Corp, США) в положении лежа. Поддерживайте голову животного посредством введения ухо баров и зуб бар. На данный момент, животные могут быть помещены в магнитно-резонансной томографии для визуализации. Животное остается под наркозом и свободного дыхания во всей процедуре визуализации. 2. Мониторинг Во время всей процедуры обработки изображений, некоторые физиологические реакции должны постоянно контролироваться и быть как можно более постоянным. Это важно, так как эти реакции могут сильно различаться по сравнению с аналогичным временным окном, как сигнал phMRI, а также влиять на сигнал интерес. Также важно, учитывая, что животное будет помещено в маГнет и, следовательно, вне поля зрения и не поддаются стандартной проверки глубины анестезии (например, палец щепотку), для обеспечения адекватной глубины анестезии. Кроме того, учитывая, что многие наркотики изменяют сердечно-сосудистых параметров, таких как кровяное давление, измерение этих важно обеспечить внимание могут быть приняты глобального физиологические эффекты действия препарата в данных phMRI. См. также раздел 4 базовых ценностей и ожидаемый ответ на вливание 5 мг / кг флуоксетин. Температура тела поддерживается на уровне 37 ± 1,5 ° С теплым системы воздушного отопления (SA инструменты, Нью-Йорк, США). Знайте, что МРТ может повлиять измерения температуры, проверить это с помощью собственной системы. Мониторинг и запись дыхания животного, используя дыхательные манжеты связан с датчиком давления (SA инструменты, Нью-Йорк, США). Запись инвазивного артериального давления крови с помощью датчика давления (TSD104A, Biopac системы Корпорация, США) и периодически сниматьбы анализировать артериальной крови проб газа (RapidLab, Siemens диагностики) через бедренную артерию канюлированные во время съемки для мониторинга артериального рСО 2 и парциальное давление кислорода (рО 2). Используйте канюлированные бедренной вены в качестве основной линии инфузии для фармакологической проблемы (флуоксетин (флуоксетин гидрохлорид от Sigma-Aldrich, Великобритания) раствора, 5 мг / кг, растворенный в физиологическом растворе). В естественных изображений Схематическое изображение МРТ экспериментальной установки приведена на рис 2. 3. Параметры изображения Когда животное находится внутри сканера и продолжает демонстрировать стабильный физиологических реакций, работы с изображениями может начаться. В наших исследованиях мы использовали 4,7 T мелких животных МРТ система (Agilent Technologies) с цилиндрическим квадратурной приема / передачи РЧ катушки 72 мм, внутренний диаметр (m2m изображений Corp, США). Сделайте три изображения разведчик самолет правильно Pложное высказывание мозга в середине МРТ поле зрения и использовать локализованную коррекцию прокладку (FastMap последовательность), чтобы улучшить однородность магнитного поля в головном мозге. Для каждого животного, сначала приобрести T2-анатомических объемное изображение для регистрации и сегментации целей. Мы использовали турбо последовательности спинового эха с эхо поезда длина = 8; Размер матрицы = 256 х 256; FOV = 50 х 50 мм 2, с чередованием приобретение 30 смежных корональных ломтиками толщиной 1 мм, в центре 8 мм каудально по отношению к заднему краю в обонятельной луковице, средние = 4, TR / TE = 5112/60 мс. Убедитесь, что животное его физиологических реакций являются постоянными перед началом сканирования phMRI. Для приобретения временных рядов, мы использовали те же Т2-турбо последовательности спинового эха с эхо поезда длина = 16; Размер матрицы = 128 х 128, с чередованием приобретения 20 смежных с ломтиками толщиной 1 мм с центром в той же позиции, TR / TE = 4915/60 мс. В общей сложности мы получили 32 очков времяcquisition время 158 сек на время объем серии и общее время сканирования 84 мин. В первом томе используется в качестве "фиктивных сканирование по решению T1 эффекты насыщения и не используются в анализе данных. Другие последовательности МРТ, такие как градиент эхо или эхо-планарной томографии (EPI) последовательности также могут быть использованы. Убедитесь в том, чтобы оценить стабильность сигнала в вашей последовательности выбора перед началом эксперимента. Получить количество базовых объемов, перед введением препарата проблемой. Мы предлагаем как минимум 10 минут базовых приобретения в стабильных условиях. Начать настой ровно то же время для всех животных. В нашем протокол, мы начали администрация в начале 9-го тома (после примерно 21 сканирование базовой мин). После инфузии, получения изображений продолжалась еще 60 минут (32 томов в общей сложности). Убедитесь, что после инфузии период достаточно долго, чтобы визуализировать изменения и достичь устойчивого состояния или восстановления сигнала, в зависимости от ваших исследований questiна ваш выбор и наркотиков проблемой. Когда получения изображения закончится, удалите животное со сканера. Выполните окончательное измерение газов крови, чтобы обеспечить стабильность параметров газов крови и дать оценку эффектов препаратов на основных физиологии. Обработка данных 4. Физиологические ответы Ожидаемое физиологические реакции на этот вызов, зависит от выбранного препарата. Ниже общепринятых базовых величин (взрослых самцов крыс) и ожидаемые ответы на инфузии 5 мг / кг флуоксетин даны. Частота дыхания должна быть стабильной на 45-75 вдохов / мин. Фармакологические проблемы флуоксетин вызывает короткий подъем (15-20%) в частоте дыхания. Артериальное давление должно быть постоянным, так и между 100-150 мм рт.ст. (Biopac системы корпорации, Goweta, США). Флуоксетин проблема вызывает короткое, но резкое падение около 20% артериальное давление.Это должно восстановить в течение 5-10 минут. Это показано на рисунке 3. Значения газов крови должна быть стабильной (измерение по крайней мере в два раза) и в следующих диапазонах перед началом сканирования phMRI: рСО 2, 35-45 мм рт.ст., рО 2, 80-130 мм рт.ст., рН, 7.35-7.45. Всегда проверяйте эти значения снова после сканирования, чтобы увидеть, если животное остается стабильной и дать оценку эффектов препаратов на основных физиологии. Высокие значения рСО 2 будет вызывать расширение сосудов и, таким образом, не видеть BOLD изменения сигнала. Убедитесь в том, что животное находится под непрерывным и постоянным уровнем анестезии (2 ± 0,25%, более высоком уровне может вызвать угнетение цереброваскулярной реактивности и нижней недостаточной анестезии и, следовательно, движение), перед началом сканирования phMRI и, главное, избегать любых изменений в анестезия режима (например,% изофлуран и / или газа) в функциональном захвата изображений, так как это может также повлиять на BOLD сигнала. <p cдевушка = "jove_title"> 5. Предварительная обработка данных МРТ Здесь мы опишем несколько шагов в предварительной обработки данных, MR, чтобы optimalize данных для статистического анализа. Отметим инструменты, которые используются в нашей лаборатории, однако многие различные инструменты имеются. 5,1 Подготовка данных Положить сырые изображения в нужный формат файла для МРТ программного обеспечения для анализа, который вы предпочитаете использовать (или NIfTI1.1 Analyze7.5 формат программы FSL). Несколько бесплатных программ конвертер файлов доступны в Интернете. В зависимости от используемого сканера, может быть, нужно сначала построить 3D (анатомическое сканирование) или 4D (phMRI сканирования) изображения всех отдельных 2D ломтиками. Это можно сделать с помощью программы обработки изображений, такие как ImageJ 1. В целях обеспечения совместимости с алгоритмами анализа предназначена для использования с человеческим данных (например, FSL программ), воксела размер должен быть умножено на коэффициент 10 (это также можно сделать с помощью, например ImageJ). В нашем исследовании, это привело к воксела размером 3,91 х 3,91 х 10 мм 3. Визуально проверить изображения за нарушения ориентации, артефакты, и движения. Будьте осторожны, чтобы не использовать сканирование с четким артефактов или чрезмерное движение в анализе, так как они искажают вам результаты. Ориентация всех сканирования должны быть похожи между анатомических и функциональных образов и в соответствии с используемой ссылкой мозга. В нашем исследовании мы использовали шаблон стереотаксической головной мозг крыс описывается Шварц 14. FSL команда fslswapdim могут быть использованы для переориентации. 5,2 коррекции движения Для исправления для любого движения предметов в серии 4D время мы использовали инструмент коррекции движения McFlirt (коррекции движения с использованием линейной регистрации изображения FMRIB в инструмент, часть программного обеспечения библиотеки FMRIB, в www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT находится внутри модального коррекции движения инструмента деigned имеет для использования на МРТ временных рядов и на основе оптимизации и регистрации методов, используемых в флиртовать, полностью автоматизированный инструмент для линейных (аффинных) интермодальных регистрации изображения мозга. Всегда проверяйте, потом, если результат будет удовлетворительным. 5,3 мозга сегментация Удалить все без ткани мозга от образа всю голову, как для серии 4D время как 3D-изображение анатомических. Для этого мы использовали ставку FSL инструмента (инструмент для извлечения мозга v 2.1, часть программного обеспечения библиотеки FMRIB, в www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Настройки по умолчанию разработана для использования с человеческим мозгом и, таким образом, не подходит для мозга крыс. Мы использовали следующие параметры: дробное порог интенсивности, F = 1,0; вертикальный градиент в дробных порог интенсивности, г = 0,1, а голова радиус (в мм), г = 175 для большинства животных. При необходимости, вы можете оптимизировать эти значения по каждому предмету. 6. Данные анас Цель статистического анализа данных MR является определение вокселей, которые обладают дополнительными дисперсии связано с наркотиками проблем в статистически надежный способ. Различные методологические подходы для этого, даже как счетное программных пакетов. Этот выбор зависит от наличия программного обеспечения и знание / опыт в вашей лаборатории и ваш конкретный вопрос исследования. Здесь мы приведем предложил метод, который используется в нашей лаборатории. 6,1 Прежде чем анализировать данные МРТ, определить общие линейные модели (GLM), к которому эти данные будут установлены. Это может быть простой квадрат-офф модели (с предварительной наркотиков и на период после введения препарата) или конкретной модели, основанной на данных. Мы использовали программу стимулирования 21 до определения данных на основе GLM модель. Выполните два образца T-тест (например, стимулирование) на всех базовых объемов против всех пост-задачи томов. При желании, оставить оут первого тома (ов), а объем в течение которого задача дается, так как те, кто не может представлять стационарных изображений. Впоследствии, дискриминация все вокселей более определенное изменение в% от исходного уровня. Мы использовали все вокселей более чем на 1% изменения. Далее, средний курс времени во всех этих вокселей, который уже дает представление о форме модели. Таким образом, можно определить, если проблема 1) имеет непосредственного или замедленного действия, 2) при условии, что эффект достигает плато и / или пика и 3) если или когда эффект снижается еще раз во время хода сканирования. Примеры приведены на рисунке 4А и 4В. 6,2 Следующим шагом является то, чтобы статистически проверить сырье времени 4D серии образ каждого животного по сравнению с предыдущим создана GLM модель. Для этого мы использовали программу FSL ПОДВИГ (FMRI инструмент анализа экспертов, v5.98) 17,24. Однако, другие МРТ инструменты анализа availablé также. В инструмент анализа, первый анализ уровня должен быть создан. Для этого необходимо выполнить следующие действия: Убедитесь в том, чтобы использовать те же настройки для каждого животного. Вы можете выбрать для удаления первых (двух) объемы до анализа, так как стационарное изображение не может быть достигнута еще в этой точке. Установить TR, это время (в секундах) между началом каждого последующего объема. Так как вы смотрите на воздействие, которое может длиться все время сканирования, нет необходимости устанавливать высокий или низкий фильтр. Пространственно сгладить данные для того, чтобы снизить шум и улучшить отношение сигнал-шум (SNR) отношения. Мы выбрали FWHM ядра 8 мм. Теперь запустите желаемое GLM модель данных. Это ваш основной объясняющей переменной (EV), т.е. сигнал вы тестируете ваши данные от. GLM, который был определен на основе нашей собственной данные можно увидеть на рисунке 4C. Существует также возможность добавления дополнительных тупик Е.В., такие как параметры движения,низкочастотный шум (сканер дрейф) или даже физиологических параметров, таких как кровяное давление, чтобы удалить общие физиологические эффекты препарата. В FEAT: использование пленки prewhitening. Добавить временной производной. На вкладке Контрасты и F-тестов, создание контраста. Для преобразования одного EV в образ статистику Z, установите его значение контрастности 1. Это дает вам все вокселей, в котором свое время курс может быть существенно объясняется GLM. Установка значения -1 даст отрицательный активации. После проведения начальной статистический тест, в результате статистика изображение должно быть thresholded чтобы показать, какие вокселей или групп вокселей активируются при определенном уровне значимости. Несколько сравнений коррекция необходима в связи с большим количеством мозга вокселей испытания. ПОДВИГ FSL программа использует автоматизированную кластер на основе многократной коррекции сравнения основаны на GRF (гауссовского случайного поля) теория 25. Наконец, данные должны быть пространственно нормированы на эталонный образ для того, чтобы выполнять группу статистики. Первая регистрация функциональных данных животных мозга извлечены анатомические изображения, а затем с эталонным изображением. Мы использовали шаблон стереотаксической головной мозг крыс описывается Шварц 14, ссылка мозга. После этого первый уровень анализа всех видов животных могут быть объединены в более высоком уровне (группы) статистического анализа. Это очень сильно зависит от вашего собственного дизайна исследования и научно-исследовательских вопросов. 6,3 После этого первый уровень анализа всех видов животных могут быть объединены в более высоком уровне (группы) статистического анализа. Это очень сильно зависит от вашего собственного дизайна исследования и научно-исследовательских вопросов. 6,4 Физиологические реакции препарата могут быть связаны или соотносятся с MR сигнал, если это необходимо. См. также раздел 6.2.3 о добавлении тупик электромобилей. 7. Представитель Результаты ove_content "> Когда сложных препарата (5 мг / кг внутривенно флуоксетин) входит в сосудистой системе, ясно физиологическая реакция должна быть видна в частоте дыхания (вверх) и артериальное давление (вниз). Эти ответы нормализации в среднем в течение 5-10 мин . На рисунке 3 это падение артериального давления хорошо видна. Средний курс времени сигнал должен показывать относительно стабильные базовые и четкое влияние этой проблемы. Предпочтительно, не должно быть проблемой независимых дрейфа сигнала. Типичный пример средний курс сигнал времени можно увидеть на рисунке 5А. Артефакты, такие как депрессия дыхания / отказа или изменения в анестезии часто хорошо видны в сигнале. Угнетение дыхания отрицательно скажется на сигнал во всем мозге. Это можно видеть на рисунке 5B. После первого анализа уровня активации модель, как ожидается, в основном, положительные и LocaТед в отдельных регионах только (т.е. областей коры, гиппокамп, гипоталамус и таламус, см. Рисунок 6а). Если весь мозг отключается, это часто указывает на слишком глубокий наркоз и / или нехватку кислорода во время сканирования. Пример этого можно увидеть на рис 6В. Рисунок 1. Место размещения канюли в бедренную артерию и вену. Рисунок 2 Схематическое изображение установки МРТ,. Все оборудование должно быть неферромагнитных и подключен к модулю системы, которая позволяет закрытого приобретения изображений избежать помех от движения в связи с дыханием и / или биение сердца. Температура тела также регулируется через нагревательный модуль для мониторинга и контроля температуры животное во время съемки. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Рисунок 3. Представитель пример данные артериального давления. Существует четкое падение артериального давления видимых сразу же после начала инфузии (красная полоса). Нормальные значения достигаются еще раз в течение 10 мин. после того, как задача управления. Рисунок 4.) Ожидаемые картины активации с применением МРТ анализа программ стимулирования (красный положительной активации, синий отрицательный активации). Б) Средний курс времени всех активированных вокселей (≥ 1% изменения от исходного уровня) у всех животных. C) Пример результате GLM модель FSL / FEAT. ClИк здесь, чтобы увидеть большую цифру. Рисунок 5. Пример положительной активации. Время курс вокселей активированный (красный) после примерно форму GLM модель. Настой препарата началась около момент времени 8. Пример отрицательного активации всего мозга после очень глубокого наркоза. Время курса отрицательно активированный вокселей (синий), показывают общее снижение сигнала и не влияет проблема видна. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 6. Ожидается активизация картины после первого анализа уровня. Активация скопления вокселей (красный уellow), только в определенных областях мозга. Примеры "плохих" паттерн активации. Всего мозга отрицательные активации (синий), в то же животное, как на рисунке 5B.