Het gebruik van Farmacologische fMRI-uitdaging in de Pre-klinisch onderzoek: Toepassing op de 5-HT-systeem

Voorbereiding dier voor in vivo MRI 1. Chirurgische Cannulatie Verdoof de rat (mannelijke Wistar rat, 200-300 g) met isofluraan (5% inductie en vervolgens gereduceerd tot 1,5-2% voor onderhoud van de anesthesie bij dieren voorbereiding en scannen) die in medische lucht (21% O 2, BOC Verenigd Koninkrijk) . Zorg ervoor dat het dier goed verdoofd en vertoont geen reactie op een teen knijpen. De femorale slagader en ader worden gecanuleerd voor bloed gas-en bloeddrukmetingen en toediening van het geneesmiddel uitdaging respectievelijk. Tijdens de chirurgische ingreep, wordt het dier de lichaamstemperatuur gecontroleerd en onderhouden door middel van een rectale sonde en een thermische deken (Harvard toestellen). De verdoofde dier wordt geplaatst op een warming-pad onder een stereomicroscoop in dorsale decubitus. Scheer het midden van de dij en veeg de huid met alcohol. Maak een 2 cm incisie in de huid langs de vouw gevormd door de buik en de rechterdij.Stompe dissectie van de adductoren wordt gebruikt om de femorale slagader, ader en de femorale zenuw te visualiseren. Scheid voorzichtig de schepen. Voorzichtig volledig binden een zijde ligatuur rond het distale einde van het vat en plaats een band met de helft van een chirurgische knoop los in de proximale site. Trekken aan zowel ligaturen de bloedstroom omsluiten de resterende middengedeelte van het vat liggen tussen de ligaturen. Een kleine insnijding van ongeveer een derde van het vaartuig omtrek van dit gedeelte van het vat om het inbrengen van een PE-50 canule (0,54 mm inwendige diameter en 0.96mm externe diameter bij mannelijke ratten anders 0,40 mm ID en 0,80 mm ED) in het vat. De canule worden geplaatst enkele mm (ten minste 5) in het vat. Zodra in de holte, spoelen een kleine hoeveelheid gehepariniseerde zoutoplossing (15 UI / ml) door het vat aan elke vorming van bloedstolsels te voorkomen. De proximale zijde lus wordt ook volledig geligeerd aan de canule op te lossen. REPEAT deze procedure voor de tweede schip. Lijm de huid met een Vetbond Weefsellijm (3M Britse plc, Bracknell, Verenigd Koninkrijk) wanneer beide canules op hun plaats zitten. Zie figuur 1 voor de exacte plaatsing van de canules. Plaats het dier in een MR-compatibele stereotactische bed (M2M Imaging Corp, USA) in een horizontale positie. Houd de kop van het dier door middel van het inbrengen van oor bars en een tand bar. Op dit punt kan het dier worden geplaatst in de MRI-scanner voor beeldvorming. Het dier blijft onder narcose gebracht en is vrij ademen gedurende de gehele beeldvorming procedure. 2. Monitoring Gedurende de gehele beeld procedure moeten verschillende fysiologische reacties continu worden bewaakt en worden zo constant mogelijk is. Dit is noodzakelijk omdat deze reacties kunnen sterk variëren hetzelfde tijdsinterval als phMRI signaal en invloed op het signaal van belang. Het is ook belangrijk, aangezien het dier worden geplaatst in de magnet en is daardoor uit het zicht en niet vatbaar voor standaard controles van de narcose diepte (bv. teen knijpen), voor het waarborgen van een adequate verdoving diepte. Daarbij komt nog dat veel medicijnen cardiovasculaire parameters zoals bloeddruk te veranderen, een meting van deze is van cruciaal belang om ervoor te zorgen rekening kan worden gehouden van de wereldwijde fysiologische gevolgen van de actie van het geneesmiddel in de phMRI gegevens. Zie ook rubriek 4 voor de uitgangswaarden en de te verwachten reacties op de infusie van 5 mg / kg fluoxetine. Lichaam temperatuur op 37 ± 1,5 ° C door een warme lucht verwarmingssysteem (SA Instruments, New York, USA). Wees ervan bewust dat MRI kan de temperatuur meting van invloed zijn, controleer dit met uw eigen systeem. Controleren en vastleggen van het dier ademhaling met behulp van een respiratoire manchet gekoppeld aan druksensor (SA Instruments, New York, USA). Neem invasieve arteriële bloeddruk met behulp van een druksensor (TSD104A, Biopac Systems Corp, USA) en op gezette tijden trekt eenzou analyseren van arteriële bloed gas monsters (RapidLab, Siemens diagnostische) via de gecanuleerde femoralis tijdens de beeldvorming van de arteriële pCO 2 en partiële druk van zuurstof (pO 2) te bewaken. Gebruik de gecanuleerde femorale ader als de belangrijkste infuuslijn voor de farmacologische challenge (fluoxetine (fluoxetine hydrochloride van Sigma-Aldrich, Verenigd Koninkrijk)-oplossing, 5 mg / kg, opgelost in een zoutoplossing). In vivo beeldvorming Een schematische weergave van de experimentele opstelling fMRI is in figuur 2. 3. Afbeeldingsparameters Als het dier eenmaal is geplaatst in de scanner en blijft om te laten zien stabiele fysiologische reacties, kan beeldvorming te starten. In onze studies hebben we gebruik gemaakt van een 4,7 T MRI-systeem voor kleine dieren (Agilent Technologies) met een cilindrische kwadratuur zend / RF-spoel met 72 mm binnendiameter (M2M Imaging Corp, USA) te ontvangen. Maak een drie vliegtuig scout afbeelding om de juiste pSTANDPUNT de hersenen in het midden van de MRI-gezichtsveld en gebruik maken van lokale shim correctie (fastmap volgorde) om het magnetisch veld homogeniteit in de hersenen te verbeteren. Voor elk dier in de eerste verwerven van een T2-gewogen anatomische afbeelding volume voor registratie en segmentatie doeleinden. We gebruikten een spin-echo sequentie turbo echo treinen = 8; matrix formaat = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm 2, waartussen verkrijging van 30 opeenvolgende segmenten met een corona mm, gecentreerd 8 mm caudaal de achterrand van de bulbus olfactorius; gemiddelden = 4; TR / TE = 5112/60 ms. Zorg ervoor dat het dier zijn fysiologische reacties zijn constant voor aanvang van de phMRI scan. Voor de tijdreeks overname hebben we gebruik gemaakt van dezelfde T2-gewogen turbo spin echo sequentie met echo lengte van de trein = 16; matrix size = 128 x 128, met interleaved overname van 20 aaneengesloten plakjes met 1 mm dik gecentreerd op dezelfde plaats; TR / TE = 4915/60 ms. In totaal hebben we 32 tijd verworven punten met een acquisition tijd van 158 seconden per tijdreeksen volume en een totale scan tijd van 84 min.. Het eerste deel wordt gebruikt als een "dummy scan T1 verzadigingseffecten pakken en niet in de analyse. Andere fMRI sequenties zoals gradient echo of echo planaire beeldvorming (EPI) sequenties kunnen ook worden gebruikt. Zorg ervoor dat het signaal stabiliteit van uw volgorde van keuze te beoordelen voor aanvang van uw experiment. Het verwerven van een aantal van de baseline volumes, vóór de toediening van de uitdaging medicatie. Wij stellen voor ten minste 10 minuten van de baseline-acquisitie onder stabiele omstandigheden. Start de infusie op precies hetzelfde moment voor alle dieren. In onze protocol begonnen we toediening aan het begin van de 9de volume (na ongeveer 21 min basislijn scanning). Na infusie beeldopname nog 60 minuten (32 delen in totaal). Zorg ervoor dat de post-infusie periode lang genoeg is om veranderingen te visualiseren en tot de steady state of nuttige toepassing van het signaal te bereiken, afhankelijk van uw onderzoek Questien uw keuze van het geneesmiddel uitdaging. Wanneer het beeld overname wordt voltooid, verwijdert u het dier van de scanner. Voer een laatste bloedgas meting om de stabiliteit van de bloedgas parameters te waarborgen en de evaluatie van de effecten van geneesmiddelen op basis fysiologie mogelijk te maken. Gegevensverwerking 4. Fysiologische reacties Verwacht fysiologische reacties op de uitdaging afhankelijk van de gekozen geneesmiddel. Hieronder worden algemeen aanvaarde uitgangswaarden (van volwassen mannelijke ratten) en de verwachte reacties op de iv infusie van 5 mg / kg fluoxetine gegeven. Ademhaling moet stabiel zijn bij 45-75 ademhalingen / minuut. De farmacologische uitdaging van fluoxetine leidt tot een korte stijging (15-20%) in ademhaling. De bloeddruk moet constant zijn en tussen de 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, USA). De fluoxetine uitdaging leidt tot een korte maar steile daling van ongeveer 20% van de arteriële bloeddruk.Dit moet herstellen binnen 5-10 minuten. Dit is weergegeven in figuur 3. Bloedgaswaarden moet stabiel zijn (maatregel ten minste twee keer) en binnen de volgende grenzen voor aanvang van de phMRI scan: pCO 2, 35-45 mmHg; PO 2, 80-130 mmHg; pH, 7.35-7.45. Altijd opnieuw te controleren deze waarden na het scannen om te zien of het dier bleef stabiel en de evaluatie van de effecten van geneesmiddelen op basis fysiologie mogelijk te maken. Hoge pCO 2 waarden zal leiden vasodilatatie en zal dus voorkomen dat u BOLD-signaal verandert. Zorg ervoor dat het dier onder een continue en constante niveau van anesthesie (2 ± 0,25%, hogere niveaus kunnen depressie van cerebrovasculaire reactiviteit en lagere onvoldoende verdoving en dus beweging veroorzaken), voor aanvang van de phMRI scan-en belangrijker nog, te voorkomen alle wijzigingen in de anesthesie regime (bv% isofluraan en / of gas flow) tijdens de functionele beeld overname als deze kan ook van invloed op de BOLD signaal. <p class = "jove_title"> 5. Voorbewerking MRI data Beschrijven we een aantal stappen in de voorbehandeling van de MR gegevens om de gegevens voor statistische analyse optimaliseren. We noemen de instrumenten die worden gebruikt in ons lab, ongeacht het aantal verschillende tools beschikbaar zijn. 5.1 Voorbereiding van gegevens Zet de RAW-afbeeldingen in de juiste bestandsformaat voor de MRI-analyse software die u wilt gebruiken (NIfTI1.1 of Analyze7.5 formaat voor FSL-programma's). Verschillende gratis file converter programma's zijn online beschikbaar. Afhankelijk van de gebruikte scanner, kan het nodig zijn om eerst de bouw van een 3D (anatomische scan) of 4D (phMRI scan) beeld van alle afzonderlijke 2D plakjes. Dit kan met een beeldbewerkingsprogramma zoals ImageJ 1. Om verenigbaarheid met algoritmen voor gebruik met menselijke data (bijvoorbeeld FSL's), voxelgrootte moet worden vermenigvuldigd met een factor 10 (dit kan ook met bijvoorbeeld ImageJ). In onze studie, resulteerde dit in een voxel grootte van 3,91 x 3,91 x 10 mm 3. Visuele controle van je foto's voor onregelmatigheden in de oriëntatie, artefacten, en beweging. Zorg dat er geen scans te gebruiken, met duidelijke artefacten of overmatige beweging in uw analyses want zij zullen vervormen je resultaten. Oriëntatie van alle scans moeten vergelijkbaar zijn tussen de anatomische en functionele beelden en in overeenstemming met de gebruikte referentie-hersenen. In onze studie hebben we de stereotactische hersenen van de rat model beschreven door Schwarz 14. De FSL commando fslswapdim kan worden gebruikt voor heroriëntatie. 5,2 Motion correctie Om te corrigeren voor elke beweging artefacten in de 4D tijdreeksen, gebruikten we de beweging correctie hulpmiddel McFlirt (Motion-correctie met behulp van lineaire afbeelding FMRIB's Registration Tool, een onderdeel van Software FMRIB's Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT is een intra-modale motion correctie gereedschap designed voor gebruik op fMRI tijdreeksen en op basis van optimalisatie en registratie technieken die in FLIRT, een volledig geautomatiseerde tool voor lineaire (affiene) inter-modale hersenen beeldregistratie. Altijd achteraf te controleren of het resultaat bevredigend is. 5.3 Brain segmentatie Verwijder alle niet-hersenweefsel van een beeld van de hele kop, zowel voor de 4D tijdreeks als de 3D anatomische afbeelding. Hiervoor hebben we de FSL gereedschap BET (Brain Extraction Tool v. 2.1, onderdeel van Software FMRIB's Library, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). De standaardinstellingen zijn ontwikkeld voor gebruik met de menselijke hersenen en zijn dus niet ideaal voor hersenen van de rat. We hebben de volgende parameters: fractionele intensiteit drempel, f = 1,0; verticale gradiënt in fractionele intensiteit drempel g = 0,1 en kop straal (in mm), r = 175 de meeste dieren. Indien nodig, kunt u optimaliseren van deze waarden per onderwerp. 6. Gegevens Analysis Doel van de statistische analyse van de MR data is het bepalen van de voxels die extra variantie toe te schrijven aan de drug uitdaging in een statistisch robuuste wijze tentoon te stellen. Verschillende methodologische benaderingen zijn beschikbaar voor deze, zelfs als telbaar softwarepakketten. De keuze die u maakt is afhankelijk van de beschikbaarheid van software en kennis / ervaring op het lab en uw specifieke vraagstelling. Hier geven we een voorgestelde methode wordt gebruikt in ons lab. 6,1 Voor het analyseren van de MRI-gegevens, bepalen van een algemeen lineair model (GLM) waarnaar de gegevens worden gemonteerd. Dit kan een eenvoudige vierkante on-off model (off voor pre-drug en voor post-infusie van het geneesmiddel) of een specifiek model op basis van de gegevens. Wij hebben gebruik gemaakt van het programma Stimuleren van 21 tot en met een data-based GLM model te bepalen. Uitvoeren van een twee-sample T-test (bijvoorbeeld stimuleren) alle basislijn volumes tegen alle post-challenge volumes. Optioneel, laat out het eerste volume (s) en het volume waarin de uitdaging wordt gegeven, omdat deze misschien niet de steady-state beeldvorming. Vervolgens discrimineren alle voxels met meer dan een bepaald% verandering tov de uitgangswaarde. We hebben allemaal voxels gebruikt met meer dan 1% verandering. Vervolgens gemiddelde tijdsverloop in deze voxels, die reeds geeft een indruk van de vorm van het model. Op deze wijze kan worden vastgesteld of de uitdaging 1) onmiddellijk of vertraagde werking, 2) wanneer het effect van een plateau en / of piek en 3) of wanneer, het effect weer daalt tijdens het tijdsverloop van de bereikt te scannen. Voorbeelden zijn in figuur 4A en 4B. 6,2 De volgende stap is dan om statistisch te testen de ruwe 4D tijdreeksen beeld van elk dier ten opzichte van de vorige opgericht GLM-model. Hiervoor gebruikten we de FSL-programma FEAT (fMRI Expert Analysis Tool, v5.98) 17,24. Echter, andere fMRI analyse-instrumenten zijn beschiklijk ook. Binnen de analyse-instrument, een eerste niveau analyse moet worden opgezet. Dit vereist de volgende stappen: Zorg ervoor dat u dezelfde instellingen te gebruiken voor elk dier. U kunt ervoor gekozen om de eerste (twee) delen te verwijderen voor de analyse, omdat de steady-state beeldvorming kan nog niet worden bereikt op dat punt. Stel de TR, dit is de tijd (in seconden) tussen het begin van elke opeenvolgende volume. Omdat u zoekt op effecten die de hele scan tijd zou kunnen duren, is er geen noodzaak om een ​​hoge of lage pass filter in te stellen. Ruimtelijk glad de gegevens om geluid te verminderen en het verbeteren van de signaal-ruis (SNR) verhouding. We hebben gekozen voor een FWHM kern van 8 mm. Nu voert u de gewenste GLM-model van uw gegevens. Dit is uw belangrijkste verklarende variabele (EV), dat wil zeggen de golfvorm u het testen van uw gegevens tegen. De GLM dat werd bepaald op basis van onze data weergegeven in figuur 4C. Ook de mogelijkheid van verwarren toevoeging van extra EV zoals beweging parameters,laagfrequent geluid (scanner drift) of zelfs fysiologische parameters zoals bloeddruk om algemene fysiologische drugs-effecten te verwijderen. Binnen FEAT: Gebruik FILM prewhitening. Voeg tijdelijke derivaat. In de Contrasten & F-toetsen tab, het opzetten van een contrast. Om een enkele EV om te zetten in een Z statistiek beeld, stelt u het contrast waarde op 1. Dit geeft je alle voxels waarin het tijdsverloop hiervan aanzienlijk kan worden verklaard door de GLM. De waarde tot -1 zal de negatieve activering. Na het uitvoeren van de eerste statistische toets, de daaruit voortvloeiende statistiek beeld moet worden thresholded te laten zien welke voxels of clusters van voxels worden geactiveerd op een bepaald significantieniveau. Meervoudige vergelijkingen correctie vanwege het grote aantal geteste hersenen voxels nodig. Het FSL programma FEAT maakt gebruik van een geautomatiseerd cluster op basis van meerdere vergelijkingen correctie op basis van de GRF (Gaussian Random Field) theorie 25. Tenslotte moeten de gegevens ruimtelijk genormaliseerd naar een referentiebeeld, zodat groep statistische voeren. Eerst registreren gegevens functionele brein de dieren geëxtraheerd anatomische beeld en vervolgens het referentiebeeld. We gebruikten de stereotactische hersenen van de rat model beschreven door Schwarz 14 als referentie hersenen. Hierna kan het eerste niveau analyses van alle dieren worden gecombineerd hoger (groepen) statistische analyses. Dit is sterk afhankelijk van uw eigen studie design en onderzoeksvragen. 6,3 Hierna kan het eerste niveau analyses van alle dieren worden gecombineerd hoger (groepen) statistische analyses. Dit is sterk afhankelijk van uw eigen studie design en onderzoeksvragen. 6,4 Fysiologische geneesmiddel reacties kunnen worden gekoppeld of gecorreleerd met de MR, indien gewenst. Zie ook paragraaf 6.2.3 over het toevoegen van beschamen EV's. 7. Representatieve resultaten ove_content "> Als de uitdagende drug (5 mg / kg iv fluoxetine) het vasculaire systeem binnenkomt, moet een duidelijke fysiologische reactie zichtbaar zijn in de ademhaling (omhoog) en de bloeddruk (omlaag). Deze reacties normaliseren gemiddeld binnen 5-10 min . In figuur 3 bloeddrukverlaging duidelijk zichtbaar. De gemiddelde signaal tijdsverloop moet blijken een relatief stabiele basislijn en een duidelijk effect van de uitdaging. Bij voorkeur dient er geen probleem onafhankelijk drift in het signaal. Een representatief voorbeeld van een gemiddelde signaal tijdsverloop te zien in fig. 5A. Artifacts, zoals ademhaling depressie / falen of veranderingen in de anesthesie zijn vaak duidelijk zichtbaar in het signaal. Ademhalingsdepressie een negatieve invloed op het signaal in de hele hersenen. Dit is te zien in figuur 5B. Na het eerste niveau analyse wordt de activering patroon naar verwachting overwegend positief en locatieTed in bepaalde regio's alleen (dat wil zeggen corticale gebieden, hippocampus, de hypothalamus en de thalamus, zie figuur 6A). Als de hele hersenen is uitgeschakeld, is dit vaak een indicatie van te diep anesthesie en / of zuurstof tekort tijdens het scannen. Een voorbeeld hiervan is te zien in figuur 6B. Figuur 1. Locatie van de plaatsing van de canules in de femorale slagader en ader. Figuur 2 Schematische weergave van de MRI installatie;. Alle apparatuur moet niet-ferromagnetische en is verbonden met een module systeem waarmee gated verwerven van beelden te vermijden storingen van beweging door ademhaling en / of hartslag. De lichaamstemperatuur wordt ook geregeld door middel van een verwarmings-module te volgen en het dier temperatuur te regelen tijdens de beeldvorming. Klik hier voor grotere afbeelding . Figuur 3. Representatief voorbeeld van bloeddrukdata. Er is een duidelijke verlaging van de bloeddruk direct zichtbaar na de start van de infusie (rood). Normale waarden zijn weer bereikt binnen 10 minuten. na de uitdaging administratie. Figuur 4. A) Verwachte activatie patroon met behulp van de MRI-analyse-programma stimuleren (rood is positief activering, blauw is negatief activering). B) De gemiddelde tijdsverloop van alle geactiveerde voxels (≥ 1% verandering tov de uitgangswaarde) in alle dieren. C) Voorbeeld van de resulterende GLM model in FSL / FEAT. Click hier om een grotere afbeelding weer te geven. Figuur 5. Voorbeeld positieve activering. Het tijdsverloop van het actieve voxels (rood) na ongeveer de vorm van het GLM model. Infusie van het geneesmiddel begon rond de tijd punt 8. Voorbeeld van een negatieve activatie in hele hersenen na te diep anesthesie. Het tijdsverloop in de negatief geactiveerde voxels (blauw) tonen een algemene daling in signaal en geen effect van de uitdaging zichtbaar is. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 6. Verwachte activatie patroon na het eerste level analyse. Activering van clusters van voxels (rood naar yellow), slechts in specifieke hersengebieden. Voorbeeld van een 'slechte' patroon voor activering. Gehele hersenen negatieve activeren (blauwe) in hetzelfde dier in figuur 5B.