Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Vorbereitung für Tier in vivo MR-Bildgebung 1. Chirurgische Kanülierung Anesthetize der Ratte (Wistar Ratten, 200-300 g) mit Isofluran (5% Induktion und dann reduziert auf 1,5 bis 2% für die Aufrechterhaltung von Narkosen bei Tier-und Scan-Vorbereitung) in der medizinischen Luft gegeben (21% O 2, BOC UK) . Stellen Sie sicher, dass das Tier betäubt ist gut und zeigt keine Reaktion auf einen Zeh Prise. Die Arteria und Vena femoralis sind für Blut-Gas-und Blutdruckmessungen und der Verabreichung des Arzneimittels Herausforderung beziehungsweise eine Kanüle eingeführt. Während des chirurgischen Eingriffs wird der Körper des Tieres Temperatur überwacht und aufrechterhalten durch eine rektale Sonde und einer Wärmedecke (Harvard Apparatus). Die narkotisierten Tier wird auf einem Pad Erwärmung unter einem Binokular in Rückenlage positioniert. Rasieren Sie die Mitte der Oberschenkel-Bereich und Tupfer die Haut mit Alkohol. Machen Sie einen 2 cm langen Hautschnitt entlang der Falte durch den Bauch und am rechten Oberschenkel gebildet.Stumpfe Dissektion der Adduktoren wird verwendet, um die femorale Arterie, Vene und den N. femoralis zu visualisieren. Trennen Sie sorgfältig die Gefäße. Sanft binden einen Seidenfaden vollständig um das distale Ende des Gefäßes und stellen eine weitere Bindung mit der Hälfte eines chirurgischen Knoten lose in der proximalen Seite. Anwendung von Zugkraft auf beide Ligaturen, um den Blutfluss in der verbleibenden mittleren Teil des Behälters zwischen den Ligaturen ausgesetzt zu verschließen. Einen kleinen Einschnitt von etwa einem Drittel der Behälterumfang in diesem Teil des Gefäßes zu ermöglichen Einführen einer Kanüle PE-50 (0,54 mm Innendurchmesser und 0,96 mm für Außendurchmesser bei erwachsenen männlichen Ratten, sonst 0,40 mm ID und 0,80 mm ED) in das Gefäß. Die Kanüle sollte mehreren mm (mindestens 5) in das Gefäß eingeführt werden. Wenn in das Lumen, flacher eine geringe Menge an heparinisierter Kochsalzlösung (15 IE / ml) durch das Gefäß, um eine Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Das proximale Seide Schleife ist auch völlig, um die Kanüle zu fixieren ligiert. Riederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Behälter. Kleben Sie die Haut mit Hilfe eines Vetbond Gewebekleber (3M UK plc, Bracknell, UK), wenn beide Kanülen an ihrem Platz sind. Siehe Abbildung 1 für eine exakte Platzierung der Kanülen. Platzieren Sie das Tier in einer MR-kompatiblen stereotaktischen Bett (M2M Imaging Corp, USA) in Bauchlage. Pflegen Sie den Kopf des Tieres durch die Einfügung von Ohr Bars und einer Zahn-Bar. An diesem Punkt kann das Tier in der MRI-Scanner zum Abbilden abgegeben werden. Das Tier bleibt betäubt und ist frei atmenden über den gesamten Imaging-Verfahren. 2. Überwachung Während der gesamten Imaging-Verfahren, sollten mehrere physiologischen Reaktionen ständig überwacht werden und so konstant wie möglich gehalten werden. Dies ist wichtig, da diese Reaktionen sehr unterschiedlich sein kann im gleichen Zeitfenster wie die phMRI Signal und auch Einfluss auf das Signal von Interesse. Es ist auch wichtig, da das Tier in der ma platziert werdengnet und ist deshalb aus den Augen und entziehen sich der Standard-Checks der Narkosetiefe (z. B. Zeh Prise), für eine angemessene Narkosetiefe. Zusätzlich, da viele Medikamente Herz-Kreislauf-Parameter wie Blutdruck zu verändern, ist eine Messung dieser kritischen, um sicherzustellen, wegen der globalen physiologischen Wirkungen des Arzneimittels die Aktion in den phMRI Daten ergriffen werden können. Siehe auch Abschnitt 4 für die Baseline-Werte und die zu erwartenden Reaktionen auf die Infusion von 5 mg / kg Fluoxetin. Die Körpertemperatur wurde bei 37 ± 1,5 ° C durch einen Heizofen (SA Instruments, New York, USA). Seien Sie sich bewusst, dass der MR-Bildgebung kann die Temperaturmessung beeinflussen, prüfen Sie dies mit Ihrem eigenen System. Überwachen und Aufzeichnen des Tieres Atemfrequenz mittels eines Atem-Manschette, die mit Drucksensor (SA Instruments, New York, USA). Notieren invasiven arteriellen Blutdrucks mit einem Druckwandler (TSD104A, Biopac Systems Corp, USA) und in regelmäßigen Abständen ein Rücktrittd arteriellen Blut Gasproben (Rapidlab, Siemens diagnostischen) über den kanülierten Femoralarterie analysieren während der Bildgebung zu arteriellen pCO 2 und der Sauerstoff-Partialdruck (pO 2) zu überwachen. Verwenden Sie den kanülierten femoralis als Haupt-Infusionsleitung für die pharmakologische Herausforderung (Fluoxetin (Fluoxetinhydrochlorid von Sigma-Aldrich, UK)-Lösung, 5 mg / kg, in Kochsalzlösung gelöst). In-vivo-Bildgebung Eine schematische Darstellung der fMRT Versuchsaufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. 3. Bildgebungsparameter Sobald das Tier im Inneren des Scanners gelegt und sind weiterhin stabil physiologischen Reaktionen zeigen, können bildgebende starten. In unseren Untersuchungen verwendeten wir eine 4,7 T MRT-System kleines Tier (Agilent Technologies) mit einem zylindrischen Quadratur Sende / Empfangs-HF-Spule mit 72 mm Innendurchmesser (M2M Imaging Corp, USA). Machen Sie eine drei ebenen Scout Bild auf P stellen richtigOSITION das Gehirn in der Mitte des MRI Sichtfeld und mit lokalisierten Shim Korrektur (FastMap Sequenz), um das Magnetfeld Homogenität im Gehirn verbessern. Für jedes Tier, zunächst einen T2-gewichteten Bild anatomische Volumen für die Registrierung und Segmentierung Zwecke. Wir verwendeten eine Turbo-Spin-Echo-Sequenz mit Echo Zuglänge = 8; Matrix size = 256 x 256, FOV = 50 x 50 mm 2; mit verschachtelten Erwerb von 30 zusammenhängenden koronalen Scheiben mit 1 mm Dicke, zentriert 8 mm kaudal bis zum hinteren Rand der Riechkolben; Durchschnitte = 4; TR / TE = 5112/60 ms. Achten Sie darauf, das Tier seiner physiologischen Reaktionen sind konstant, bevor Sie den Scan-phMRI. Für die Zeitreihen Erwerb verwendeten wir die gleiche T2-gewichteten Turbo-Spin-Echo-Sequenz mit Echo Zuglänge = 16; Matrix size = 128 x 128, mit verschachtelten Erwerb von 20 zusammenhängenden Scheiben mit 1 mm Dicke an derselben Position zentriert; TR / TE = 4915/60 ms. Insgesamt erwarben wir 32 Punkte mit einem aÜ bernahme der Zeit von 158 Sekunden pro Zeitreihen Volumen und insgesamt Scan-Zeit von 84 min. Der erste Band wird als "Dummy-Scan" verwendet, um T1 Sättigungseffekte anzusprechen und nicht in der Datenanalyse verwendet. Andere Sequenzen, wie fMRI Gradientenecho oder Echo-Planar-Bildgebung (EPI)-Sequenzen können ebenfalls verwendet werden. Achten Sie darauf, um das Signal der Stabilität Ihrer Sequenz der Wahl vor Beginn des Experiments zu beurteilen. Erwerben Sie eine Reihe von Baseline-Bände, vor Verabreichung der Medikamente Herausforderung. Wir schlagen vor, mindestens 10 Minuten von Baseline-Übernahme unter stabilen Bedingungen. Starten Sie die Infusion an genau der gleichen Zeit für alle Tiere. In unserem Protokoll, begannen wir Verabreichung zu Beginn der 9. Band (nach etwa 21 min Baseline-Scanning). Nach der Infusion fortgesetzt Bildaufnahme für weitere 60 Minuten (32 Bände insgesamt). Achten Sie darauf, die nach der Infusion lang genug ist, um Veränderungen sichtbar zu machen und Steady-State oder das Wiederaufleben des Signals zu erreichen, abhängig von Ihrer Forschung questiauf und Ihre Wahl der Droge Herausforderung. Bei der Bildaufnahme beendet ist, entfernen Sie das Tier aus dem Scanner. Eine abschließende Blut-Gas-Messung, um die Stabilität der Blutgasparameter zu gewährleisten und die Auswertung der Wirkung von Medikamenten auf Grundlagen der Physiologie zu ermöglichen. Datenverarbeitung 4. Physiologischen Reaktionen Erwartete physiologischen Reaktionen auf die Herausforderung, sind abhängig von der gewählten Droge. Im Folgenden werden allgemein anerkannten Ausgangswerte (von erwachsenen männlichen Ratten) und die erwarteten Antworten auf die iv-Infusion von 5 mg / kg Fluoxetin gegeben. Atemfrequenz sollte bei 45 bis 75 Atemzüge / Minute stabil. Die pharmakologische Herausforderung von Fluoxetin induziert eine kurze Anstiegszeit (15-20%) in der Atemfrequenz. Der Blutdruck sollte konstant sein und zwischen 100 bis 150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, USA). Die Fluoxetin Herausforderung induziert einen kurzen, aber steilen Abfall von ca. 20% des arteriellen Blutdrucks.Dies sollte innerhalb von 5-10 Minuten zu erholen. Dies ist in 3 gezeigt. Blutgaswerte sollte stabil sein (messen mindestens zweimal) und in den folgenden Bereichen vor dem Starten des Scan-phMRI: pCO 2, 35-45 mmHg; pO 2, 80-130 mmHg; pH-Wert, 7,35 bis 7,45. Überprüfen Sie immer wieder diese Werte nach dem Scannen zu sehen, ob das Tier blieb stabil und bis zur Auswertung der Wirkung von Medikamenten auf Grundlagen der Physiologie zu ermöglichen. Hohe pCO 2-Werte wird induzieren Gefäßerweiterung und wird somit nicht zu sehen BOLD-Signal ändert. Stellen Sie sicher, dass das Tier unter einer kontinuierlichen und konstanten Niveau der Anästhesie ist (2 ± 0,25%; höheren Ebenen können Depressionen von zerebrovaskulären Reaktivität und unteren unzureichende Betäubung und damit Bewegung verursachen), vor dem Starten des Scan-und phMRI wichtiger ist, zu vermeiden Anpassungen bei den Anästhesie-Regime (z. B.% Isofluran und / oder Gasfluss) während der funktionellen Bildaufnahme, da dies auch Auswirkungen auf die BOLD-Signal. <p class = "jove_title"> 5. Vorverarbeitung von MRT-Daten Hier beschreiben wir einige Schritte in der Vorverarbeitung der MR-Daten, um die Daten für statistische Untersuchungen optimalisieren. Wir erwähnen die Werkzeuge, die in unserem Labor verwendet werden, aber viele verschiedene Tools zur Verfügung stehen. 5,1 Datenaufbereitung Setzen Sie die RAW-Bilder in der richtigen Dateiformat für die MRI-Analyse-Software, die Sie verwenden möchten (oder NIfTI1.1 Analyze7.5 Format für FSL-Programme). Mehrere offene Datei-Konverter-Programme sind online verfügbar. Je nach verwendetem Scanner, kann es notwendig sein, zunächst eine 3D-Konstruktion (anatomische Scan) oder 4D (phMRI Scan) Image aller separaten 2D-Scheiben. Dies kann unter Verwendung eines Bildverarbeitungsprogramms, wie ImageJ 1 ist. Um die Kompatibilität mit Analyse-Algorithmen für den Einsatz mit menschlichen Daten (zB Programme FSL) entworfen zu gewährleisten, hat Voxelgröße um den Faktor 10 (dies kann auch mit zum Beispiel ImageJ werden) multipliziert werden. In unserer Studie führte dies zu einer Voxelgröße von 3,91 x 3,91 x 10 mm 3. Optisch überprüfen Sie Ihre Bilder für Unregelmäßigkeiten bei der Orientierung, Artefakte und Bewegung. Achten Sie darauf, Scans mit klaren Artefakte oder übermäßige Bewegung in Ihre Analysen verwenden, wie sie verzerren werden Sie Ergebnisse. Ausrichtung aller Scans sollte ähnlich zwischen den anatomischen und funktionellen Bilder und in Übereinstimmung mit der verwendeten Referenz Gehirn. In unserer Studie haben wir die stereotaktische Rattenhirn Vorlage von Schwarz 14 beschrieben. Das FSL-Befehl fslswapdim kann für eine Neuorientierung genutzt werden. 5,2 Bewegungskorrektur Um für eventuelle Bewegungsartefakte in der 4D Zeitreihen zu korrigieren, nutzten wir die Bewegungskorrektur Werkzeug McFlirt (Motion Correction mit FMRIB der Linear Image Registration Tool, Teil FMRIB die Software-Bibliothek, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT ist ein intra-modale Bewegungskorrektur Werkzeug designed für den Einsatz auf fMRI-Zeitreihen und auf der Basis-Optimierung und Eintragung in FLIRT Techniken verwendet, ein voll automatisiertes Werkzeug für lineare (affine) intermodalen Gehirn Bildregistrierung. Immer darauf zu überprüfen, ob das Ergebnis zufriedenstellend ist. 5,3 Gehirn-Segmentierung Löschen Sie alle nicht-Hirngewebe von einem Bild des ganzen Kopfes sowohl für die 4D Zeitreihe als die 3D-anatomische Bild. Dafür verwendeten wir den FSL-Tool BET (Brain Extraction Tool v. 2.1, Teil FMRIB die Software-Bibliothek, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Die Standardeinstellungen sind für die Verwendung mit menschlichen Gehirnen entwickelt und sind daher nicht ideal für Rattenhirn. Wir benutzten die folgenden Parameter: anteilige Intensität Schwelle, f = 1,0; Vertical Gradient in anteilige Intensität Schwelle, g = 0,1; und Kopf Radius (in mm), r = 175 für die meisten Tiere. Wenn nötig, können Sie diese Werte pro Fach zu optimieren. 6. Daten Analysis Tor der statistischen Analyse der MR-Daten ist, die Voxel, die zusätzliche Varianz zurückzuführen auf das Medikament Herausforderung in einer statistisch zuverlässige Weise aufweisen bestimmen. Verschiedene methodische Ansätze gibt es für diese, auch als zählbar Software-Pakete. Die getroffene Auswahl ist abhängig von der Verfügbarkeit von Software und Kenntnisse / Erfahrungen in Ihr Labor und Ihre spezifische Fragestellung. Hier geben wir eine Methode vorgeschlagen, wie es in unserem Labor verwendet. 6,1 Vor der Analyse der MRI-Daten, zu bestimmen einem allgemeinen linearen Modell (GLM), an dem die Daten versehen sein. Dies kann eine einfache quadratische Ein-Aus-Modell (aus für Drogen-und Pre-on für Post-Arzneimittelinfusion) oder ein bestimmtes Modell auf den Daten basiert. Wir haben das Programm Stimulieren Sie 21, um eine Daten-basierte GLM-Modell zu bestimmen. Führen Sie eine Zwei-Stichproben t-Test (zum Beispiel in Stimulieren) auf allen Bänden Baseline vs alle Post-Herausforderung Bände. Optional lassen out das erste Volumen (en) und das Volumen, in dem die Herausforderung gegeben wird, da die nicht darstellen können Steady-State-Bildgebung. Anschließend diskriminieren alle Voxel mit mehr als eine bestimmte% Veränderung zum Ausgangswert. Wir benutzten alle Voxel mit mehr als 1% Veränderung. Als nächstes Durchschnitt der zeitliche Verlauf in all diesen Voxeln, die bereits gibt Ihnen einen Eindruck von der Form des Modells. Auf diese Weise kann bestimmt werden, wenn die Herausforderung 1) eine sofortige oder verzögerte Wirkung, 2) wenn der Effekt ein Plateau und / oder Spitzen und 3) ob oder wann die Wirkung wieder abnimmt während des Zeitverlaufs der erreicht werden zu scannen. Beispiele sind in 4A und 4B gezeigt. 6,2 Der nächste Schritt ist dann, um statistisch testen Sie die RAW-4D Zeitreihen Bild jedes Tieres gegenüber dem Vorjahr festgestellt GLM-Modell. Hierzu verwendeten wir das Programm FSL FEAT (fMRI Expert Analysis Tool, v5.98) 17,24. Jedoch sind auch andere fMRI Analyse-Tools AvailaBLE als auch. Im Rahmen der Analyse-Werkzeug, eine erste Analyse auf eingerichtet werden. Dies erfordert folgende Schritte: Achten Sie darauf, die gleichen Einstellungen für jedes Tier zu verwenden. Sie können wählen, um die ersten (zwei) Bänden vor der Analyse zu löschen, da Steady-state-Bildgebung kann noch nicht an diesem Punkt zu erreichen. Stellen Sie den TR, das ist die Zeit (in Sekunden) zwischen dem Beginn eines jeden aufeinanderfolgenden Volumen. Da Sie auf Effekte, die den gesamten Scan-Zeit dauern könnte suchen, gibt es keine Notwendigkeit, ein hohes oder Tiefpassfilter gesetzt. Räumlich glatt die Daten, um Lärm zu reduzieren und zur Verbesserung der Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Wir wählten eine FWHM-Kernel von 8 mm. Jetzt starten Sie das gewünschte Modell GLM auf Ihre Daten. Das ist Ihre wichtigste erklärende Variable (EV), dh die Wellenform Testen Sie Ihre Daten sind gegen. Der GLM, die bestimmt, basierend auf unseren eigenen Daten war kann in 4C zu sehen. Es besteht auch die Möglichkeit des Hinzufügens zusätzlicher verwechseln EV wie Bewegungsparameter,tieffrequente Geräusche (Scanner Drift) oder auch physiologische Parameter wie Blutdruck, allgemeine physiologische Arzneimittel-Wirkungen zu entfernen. Innerhalb FEAT: Verwenden FILM prewhitening. In zeitlichen Ableitung. In der Kontraste & F-Tests Registerkarte Einrichtung eines Kontrasts. Um eine einzelne EV in ein Z-Statistik Bild konvertieren, stellen Sie den Kontrast Wert auf 1. Dies gibt Ihnen alle Voxel, in denen ihr zeitlicher Verlauf erheblich von der GLM erklärt werden können. Wird der Wert auf -1 geben die negative Aktivierung. Nach Durchführung der ersten statistischen Test muss das resultierende Bild auf einem Schwellenwert Statistik zu zeigen, welche Voxel oder Cluster von Voxeln zu einem bestimmten Signifikanzniveau aktiviert werden. Mehrere Vergleiche Korrektur aufgrund der großen Anzahl von Gehirnzellen Voxel getestet benötigt. Das FSL-Programm FEAT nutzt eine automatisierte Cluster-basierte multiple Vergleiche Korrektur auf die GRF (Gaussian Random Field) 25 Theorie basiert. Schließlich sollten die Daten räumlich sein normiert auf einem Referenzbild, um Gruppenstatistiken durchzuführen. Registrieren Sie zuerst die Funktionsdaten für die Tiere Gehirn extrahiert anatomische Bild und dem Referenzbild. Wir nutzten die stereotaktische Rattenhirn Vorlage von Schwarz 14 als Referenz Gehirn beschrieben. Danach kann die First-Level-Analysen von allen Tieren in höheren Ebene (Gruppe) statistische Analysen kombiniert werden. Dies ist stark abhängig von Ihrer eigenen Studiendesign und Forschungsfragen. 6,3 Danach kann die First-Level-Analysen von allen Tieren in höheren Ebene (Gruppe) statistische Analysen kombiniert werden. Dies ist stark abhängig von Ihrer eigenen Studiendesign und Forschungsfragen. 6,4 Physiologische chemotherapeutische Effekte koppelbar oder korreliert ist mit dem MR-Signal, falls gewünscht. Siehe auch Abschnitt 6.2.3 über das Hinzufügen verwechseln EV. 7. Repräsentative Ergebnisse ove_content "> Wenn die herausfordernde Medikament (5 mg / kg iv Fluoxetin) das Gefäßsystem eintritt, sollte eine klare physiologische Reaktion sein, Atemfrequenz (nach oben) und Blutdruck (unten) sichtbar. Diese Reaktionen normalisieren im Durchschnitt innerhalb von 5-10 min . In Abbildung 3 sind diese Abfall des Blutdrucks ist deutlich sichtbar. Die durchschnittliche Signal Zeitverlauf sollte zeigen eine relativ stabile Basislinie und eine klare Wirkung der Herausforderung. Vorzugsweise sollte es keine Challenge-unabhängigen Drift des Signals. Ein repräsentatives Beispiel eines durchschnittlichen Signal-Zeit-Verlauf kann in 5A zu sehen ist. Artefakte, wie Atmung Depression / Ausfall oder Veränderungen in der Anästhesie sind oft deutlich sichtbar im Signal. Atemdepression wird sich negativ auf das Signal im gesamten Gehirn. Dies kann in 5B zu sehen. Nach dem ersten Level-Analyse wird das Aktivierungsmuster erwartet, dass sie überwiegend positiv und locaTed nur in bestimmten Regionen (z. B. kortikale Areale, Hippocampus, Hypothalamus und Thalamus; siehe 6A). Wenn das gesamte Gehirn ist ausgeschaltet, ist dies oft ein Hinweis auf zu tiefe Narkose und / oder Sauerstoffmangel während des Scannens. Ein Beispiel dafür kann in 6B zu sehen. Abbildung 1. Lage der Platzierung der Kanülen in der Arteria und Vena femoralis. Abbildung 2 Schematische Darstellung der MRT-Setup;. Die gesamte Ausrüstung muss nicht ferromagnetischen und ist mit einem Modul-System, die gated Erfassung von Bildern Vermeidung von Interferenzen durch Bewegung durch Atmung und / oder Herz schlagen lässt verbunden. Die Körpertemperatur wird auch durch ein Heizmodul reguliert zu überwachen und zu steuern das Tier Temperatur während der Bilderzeugung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . 3. Repräsentatives Beispiel von Blutdruckdaten. Es gibt einen klaren Abfall des Blutdrucks sichtbar direkt nach dem Beginn der Infusion (roter Balken). Normale Werte sind wieder innerhalb von 10 min erreicht. nach der Herausforderung Verwaltung. Abbildung 4. A) die erwartete Aktivierungsmuster mit der MRT-Analyse-Programm zu stimulieren (rot ist positiv, Aktivierung, blau ist negativ Aktivierung). B) Durchschnittliche zeitliche Verlauf aller aktivierten Voxel (≥ 1% Veränderung zum Ausgangswert) bei allen Tieren. C) Beispiel der resultierenden GLM-Modell in FSL / FEAT. Click hier, um größere Abbildung zu sehen. Abbildung 5. Beispiel für die positive Aktivierung. Der zeitliche Verlauf in den aktivierten Voxel (rot) wird nach etwa der Form des GLM-Modell. Infusion des Medikaments begann um Punkt 8 der Zeit. Beispiel für negative Aktivierung im gesamten Gehirn nach Narkose zu tief. Der zeitliche Verlauf in den negativ aktiviert Voxel (blau) zeigen einen allgemeinen Rückgang der Signal und kein Effekt der Herausforderung sichtbar ist. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 6. Erwartete Aktivierungsmuster nach dem ersten Level-Analyse. Aktivierung von Clustern von Voxeln (rot yellow), nur in bestimmten Hirnarealen. Beispiel für "schlechte" Aktivierungsmuster. Whole-Brain-negativen Aktivierung (blau) in der gleichen Tier wie in 5B.