前臨床研究における薬理学的チャレンジのfMRIの利用：5-HTシステムへの応用

生体内 MRIイメージングのための動物の準備 1。外科的カニューレイソフルランでラット（Wistar系雄性ラット、200〜300 g）を麻酔（5％誘導し、動物の準備とスキャン中に麻酔を維持するために1.5から2パーセントに減少）、医療、空気中で与えられた（21％O 2、BOC英国） 。動物がよく麻酔とつま先のピンチへの無応答を示さないことを確認してください。大腿動脈と静脈は、血液ガス、血圧測定、それぞれの薬剤の挑戦を管理するためにカニューレを挿入されています。外科手術の際に、動物の体温は直腸プローブとサーマルブランケット（ハーバード装置）を通じて監視され、維持されます。 麻酔動物の背側横臥で解剖顕微鏡下で温暖化のパッド上に配置されています。半ば腿エリアとアルコールと綿棒皮膚を剃る。腹部と右大腿部によって形成された折り目に沿って2cmの皮膚切開を行います。内転筋の鈍的切開は大腿動脈、静脈や大腿神経を視覚化するために使用されています。慎重に船を分離します。 静かに容器の先端の周りに完全に絹糸結紮を結ぶと近位のサイトで大まかに外科的結び目の半分は別のネクタイを配置します。字の間に露出血管の残りの中央部分に血流を閉塞するために、両方の字にトラクションを適用します。 PE-50カニューレ（オスの成体ラットの場合には外径のために0.54ミリメートル内径0.96ミリメートル、それ以外の場合は0.40ミリメートルIDの挿入を可能にするために容器のこの部分で血管周囲の約3分の小さな切開を行い、容器に0.80ミリメートルED）。 カニューレは、容器に数mm（少なくとも5）を挿入する必要があります。一度腔に、血栓のいずれかの形成を避けるために容器をヘパリン生理食塩水を少量（15 UI / ml）をフラッシュします。近絹のループは、カニューレを修正するために完全に連結される。 R第二の容器について、この手順をEPEAT。接着剤の両方カニューレが所定の位置にあるときに皮膚がVetbond組織接着剤（3M英国plcは、ブラックネル、イギリス）を使用します。カニューレの正確な配置は、 図1を参照してください。 腹臥位でのMR互換性のある定位ベッド（M2Mイメージング株式会社、アメリカ）に動物を配置します。耳のバーや歯バーの挿入を介して動物の頭を維持します。この時点で、動物は、イメージングのためのMRIスキャナーに配置することができます。動物を麻酔したまま、全体のイメージングの手順を通して自由呼吸である。 2。モニタリング全体の撮像手順の間に、いくつかの生理学的応答は常に監視されるべきであり、可能な限り一定に保たれる。これらの応答はphMRI信号と同じタイム·ウィンドウの上に大きく異なり、また、目的の信号に影響を与えることができるので、これは必須です。それは動物がMAに配置されることを考えると、も重要です。GNETと視覚と適切な麻酔深度を確保するための麻酔深度の標準的なチェック（例えばつま先のピンチ）に従わないから、したがって外です。さらに、多くの薬は、血圧などの心血管パラメータを変更することを考えると、これらの測定は、アカウントがphMRIデータ内の薬物の作用のグローバルな生理学的効果が考​​慮されることを保証するために重要です。また、ベースライン値と5 mg / kgのフルオキセチンの注入に期待される応答のセクション4を参照してください。 体温が37℃に維持される±1.5℃温風暖房システム（SAインスツルメンツ、ニューヨーク、米国）。 MR画像は、温度測定に影響を与える可能性があることに注意して、独自のシステムでこれを確認してください。 圧力センサー（SAインスツルメンツ、ニューヨーク、アメリカ）に結合された呼吸器カフを用いた動物の呼吸速度を監視し、記録します。 圧力トランスデューサー（TSD104A、BIOPAC Systems社、米国）を使用して、侵襲的な動脈の血圧を記録し、定期的に撤退する動脈PCO 2と酸素分圧（PO 2）を監視するために撮像中にカニューレ大腿動脈を介して動脈血液ガスサンプル（RapidLab、シーメンス診断）分析すると思います。 薬理学的挑戦（生理食塩水に溶解したフルオキセチン（Sigma-Aldrich社、英国からのフルオキセチン塩酸塩）溶液に、5 mg / kg体重）の主な輸液ラインとして大腿静脈カニューレを使用しています。 in vivoイメージング fMRIの実験セットアップの概略図を図2に示されている。 3。撮像パラメータ動物は、スキャナの内部に配置され、安定した生理的な反応を示し続けれると、イメージングが起動することができます。我々の研究では、円筒形の直交72ミリメートル、内径（M2Mイメージング株式会社、米国）とRFコイルを送信/受信で4.7 T小動物MRIシステム（アジレント·テクノロジー）を使用しました。正しくPには、3つの平面スカウトイメージを作成するビューのMRIフィールドの真ん中に脳をosition、脳内の磁場の均一性を向上させるために、ローカライズされたシム補正（fastmapシーケンス）を使用します。 各動物は、最初の登録とセグメンテーションの目的のためT2強調解剖画像のボリュームを取得します。行列のサイズ= 256×256;我々は、エコートレイン長= 8とターボスピンエコーシーケンスを用いたFOV = 50×50ミリメートル2、厚さ1mmの30の連続した冠状スライスのインターリーブを買収し、後端に尾8ミリメートルを中心に嗅球の、平均値= 4; TR / TE = 60分の5112ミリ秒。 その生理的反応はphMRIスキャンを開始する前に一定である動物を確認してください。マトリクスサイズ= 128×128;時系列取得のために、我々はエコートレイン長さ= 16と同じT2強調ターボスピンエコーシーケンスを用いたTR / TE;同じ位置を中心とした厚さ1mmの20の連続した​​スライスをインターリーブ買収に= 60分の4915ミリ秒。合計では、で32時間ポイントを取得しました時系列ボリュームあたり158秒、84分の総スキャンタイムのcquisition時間。最初のボリュームは、T1の飽和の影響に対処するための "ダミーのスキャン"として使用され、データ解析に使用されていません。このような勾配エコーまたはエコープラナーイメージング（EPI）シーケンスのような他のfMRIのシーケンスを使用することもできます。あなたの実験の開始前に選択したシーケンスの信号安定性を評価することを確認します。 チャレンジ薬を投与する前に、ベースラインのボリュームの数を取得します。我々は、安定した条件下で、ベースラインの買収に少なくとも10分をお勧めします。すべての動物のためにまったく同時に注入を開始します。我々のプロトコルでは、第九ボリュームの先頭（約21分のベースラインスキャン後）に投与を開始しました。注入後、画像取得（全32巻）別の60分間続けた。ポスト注入期間はあなたの研究クエスティに応じて、変更を可視化し、定常状態または信号の回復に達するために十分な長さであることを確認してください上で、薬物の挑戦のあなたの選択。 画像の取り込みが完了すると、スキャナから動物を削除します。血液ガスパラメータの安定性を確保するため、基本的な生理機能に対する薬物影響の評価を有効にするには、最後の血液ガス測定を行います。 データ処理 4。生理学的反応チャレンジへの期待の生理学的反応は、選択された薬物に依存しています。以下、一般的に受け入れられている基準値（成人雄ラットの）、5 mg / kgのフルオキセチンの静脈内注入に期待される応答が与えられている。 呼吸速度は45から75回/分で安定でなければなりません。フルオキセチンの薬理学的課題は、呼吸率の短期上昇（15-20％）を誘導する。 血圧は一定と100から150 mmHgの（BIOPAC Systems社、Goweta、米国）との間でなければなりません。フルオキセチンの課題は、動脈血圧の20％程度の短いが急な降下を誘発する。これは5〜10分以内に回復する必要があります。これは図3に示されています。 血液ガス値が安定している（少なくとも二回測定）とphMRIスキャンを開始する前に、次の範囲内にする必要があります。PCO 2、35から45 mmHgで、pO 2は 、80から130 mmHgで、pHは7.35から7.45。常に動物が安定していたかどうかを確認するために、基本的な生理機能に対する薬物影響の評価を有効にするには、スキャンした後、再度これらの値を確認してください。高いPco 2の値は、血管拡張を誘発するため、BOLD信号の変化を見て避けることができます。 動物が麻酔の連続した​​一定レベルの下にあることを確認してください（2±0.25％より高いレベルは、脳血管反応性の抑うつと低い不十分な麻酔ので、動きを引き起こす可能性があります）重要なphMRIスキャンを開始するとする前に、任意の調整を避けるこのような機能画像取得時の麻酔体制（例えば、％イソフルランおよび/またはガスフロー）もBOLD信号に影響を与える可能性があります。 <p c少女= "jove_title"> 5。前処理MRIデータここでは、統計分析用のデータをoptimalizeするために、MRデータの前処理でいくつかの手順を説明します。我々は、しかし、多くの異なるツールが利用可能であり、私たちのラボで使用されるツールに言及。 5.1データの準備あなたは（FSLプログラムのNIfTI1.1またはAnalyze7.5形式）を使用することを好むMRI解析ソフトウェアのための正しいファイル形式のRAW画像を入れてください。いくつかの無料のファイルコンバータプログラムがオンラインで入手できます。使用するスキャナによっ​​ては、最初にすべての個別の2Dスライスの3D（解剖スキャン）または4D（phMRIスキャン）イメージを構築する必要があるかもしれません。これは、そのようなImageJの1などの画像処理プログラムを使用して行うことができます。 ヒトのデータで使用する（例えば、FSLプログラム）用に設計された解析アルゴリズムとの互換性を確保するために、ボクセルサイズはファクター10（これはまた、例えばImageJを使用して行うことができます）を乗じする必要があります。我々の研究では、これは3.91 X 3.91×10 mm 3のボクセルサイズになりました。 視覚的方向の不規則性の画像、工芸品、モーションを確認してください。彼らはあなたの結果を歪曲するのであなたの分析では明確な工芸品や過度の運動とスキャンを使用しないように注意してください。 すべてのスキャンの向きは解剖学的および機能的な画像の間、使用の基準の脳との一致で似ている必要があります。私たちの研究では、シュワルツ14で説明した定位ラット脳のテンプレートを使用していました。 FSLコマンドfslswapdimは、方向付けに使用することができます。 5.2モーション補正 4Dの時系列内の任意のモーションアーチファクトを補正するために、我々は動き補正ツールMcFlirtを（FMRIBのリニアイメージ登録ツールを使用して、モーション補正、FMRIBのソフトウェアライブラリの一部は、使用www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ）。 MCFLIRTは、イントラモーダルモーション補正ツールDESですfMRIを時系列で使用するためignedと浮気者に使用される最適化と登録手法、線形（アフィン）インターモーダル脳画像登録のための完全に自動化されたツールに基づいています。結果が良好である場合は、常に後を確認してください。 5.3脳のセグメンテーション 3D解剖画像として4Dの時系列の両方の頭部全体のイメージからすべての非脳組織を削除します。このため我々は、FSLツールのBET（脳抽出ツールV. 2.1、FMRIBのソフトウェアライブラリの一部は、使用www.fmrib.ox.ac.uk / FSLが ）。デフォルト設定は、人間の脳で使用するために開発され、その結果、ラットの脳に理想的ではありませんされています。と頭の半径（mm）で、ほとんどの動物のr = 175;小数の強度のしきい値は、g = 0.1で垂直方向のグラデーション小数の強度のしきい値は、f = 1.0：私たちは、次のパラメータを使用していました。必要であれば、テーマごとにこれらの値を最適化することができます。 6。データAnalysiの MRデータの統計解析の目的は、統計的に堅牢な方法で、薬剤チャレンジに起因する追加の分散を示すボクセルを決定することです。様々な方法論的アプローチにも数えられるソフトウェアパッケージとして、このために用意されています。あなたが作る選択は、あなたのラボで、ソフトウェアや知識/経験の可用性と具体的な研究問題に依存しています。ここで我々のラボで使用されるよう提案された方法を提供します。 6.1 MRIデータを分析する前に、データが装着されるための一般的な線形モデル（GLM）を決定します。これはオン·オフモデル（オフのプリ薬とポスト薬剤注入のための）シンプルな正方形またはデータに基づいて特定のモデルにすることができます。我々は、データ·ベースGLMモデルを決定するためにプログラムが刺激21を使用しています。 すべてのポストチャレンジボリューム対すべてのベースラインのボリュームの2つのサンプルのT-テスト（刺激の例）を実行します。必要に応じて、oを残すUTは、最初のボリューム（s）とそれらが定常状態のイメージングを表していないかもしれないので、チャレンジが与えられ、その間ボリューム。その後、ベースラインから特定の％の変化以上ですべてのボクセルを識別する。我々は1％以上の変化を持つすべてのボクセルを使用していました。 既にあなたのモデルの形状のような印象を与え、これらすべてのボクセル内の次の、平均時間のコース。課題1）は効果が効果の時間経過の間に再び低下する場合や高原、そして/または、ピークと、3）に達する場合は、即時または遅延効果、2）を持っている場合は、この方法でそれを決定することができます。スキャンします。の例を図4A及び図4Bに示されています。 6.2 次のステップでは、統計的に以前確立されたGLMモデルに対してそれぞれの動物の生の4Dの時系列画像をテストするためにしています。このため、我々は、FSLプログラムFEAT（FMRIエキスパート解析ツール、v5.98）17,24を使用していました 。しかし、他のfMRIの解析ツールを毎日ご利用いただけます。同様にBLE。解析ツールの中で、最初のレベルの分析では、設定する必要があります。これは、次の手順を実行する必要があります。 各動物について同じ設定を使用することを確認します。定常状態のイメージングがその時点でまだ到達できないかもしれないので、あなたが分析する前に、まず（2）ボリュームを削除することを選んだことがあります。 TRを設定し、これは連続する各ボリュームの開始の間の時間（秒単位）です。あなたは全体のスキャン時間を持続できる効果を見ているので、高または低域通過フィルタを設定する必要はありません。 空間的にノイズを低減し、ノイズ（SNR）比の信号を向上させるために、データを平滑化。私たちは、8ミリメートルの半値幅カーネルを選択しました。 今すぐあなたのデータ上の任意のGLMモデルを実行します。これは主説明変数（EV）は、あなたのデータを比較テストしている波形を、すなわち。我々自身のデータに基づいて決定されたGLMは、 図4Cに見ることができます。そのような動きパラメータとして追加混同するEVのを追加する可能性もあります低周波ノイズ（スキャナドリフト）や、一般的な生理的な薬物の影響を除去するために血圧などにも生理的パラメータを設定します。 内FEAT：使用フィルム前もって行う白色化。一時的な導関数を追加します。コントラスト＆F-テスト]タブで、コントラストを設定します。 Zの統計イメージにシングルEVを変換するには、1に、そのコントラストの値を設定します。これにより、その時間のコースが大幅にGLMによって説明することができるすべてのボクセルを提供します。値を-1に設定すると、負の活性化を与える。 初期の統計的検定を行った後、結果の統計イメージは、ボクセルのボクセルまたはクラスタが特定の有意水準で活性化される表示するために閾値処理する必要があります。多重比較補正は、テストされ、脳のボクセルの数が多いために必要とされる。 FSLプログラムはFEATには、GRF（ガウシアンランダムフィールド）理論25に基づいて自動化されたクラスタベースの多重比較補正を使用しています。 最後に、データは空間的でなければなりませんグループの統計情報を実行するために、参照画像に正規化。最初の動物の脳抽出した解剖学的画像にして、参照画像に機能データを登録します。我々は、参照脳とシュワルツ14で説明した定位ラット脳のテンプレートを使用していました。 この後、すべての動物の最初のレベルの分析は、より高いレベル（グループ）の統計分析で組み合わせることができます。これは、あなた自身の研究デザインや研究の質問に大きく依存しています。 6.3 この後、すべての動物の最初のレベルの分析は、より高いレベル（グループ）の統計分析で組み合わせることができます。これは、あなた自身の研究デザインや研究の質問に大きく依存しています。 6.4 必要に応じて生理的な薬物応答は、MR信号に結合または相関させることができる。また混同するEVのを追加する方法についてセクション6.2.3を参照してください。 7。代表的な結果ove_content ">挑戦的な薬（5 mg / kgの静脈内フルオキセチン）は血管系に入ると、明確な生理学的な応答は、呼吸速度（最大）と血圧（下）に表示されるはずです。これらの応答は5-10分以内に平均で正規化する図3では、血圧のこの低下ははっきりと見えるようになります。 平均的な信号の時間経過は比較的安定したベースラインと課題の明確な効果を示すべきである。好ましくは、信号のない課題に依存しないドリフトがあってはならない。平均信号の時間経過の代表的な例は、 図5Aに見ることができます。麻酔のような呼吸のうつ病/障害や変更などのアーチファクトは、信号で頻繁にはっきりと見える。呼吸抑制は負脳全体の信号に影響を与えます。これは、 図5Bに示されています。 最初のレベルの分析の後、活性化パターンは、主に正と位置であると予想される特定の地域ではテッド（すなわち皮質、海馬、視床下部と視床、 図6Aを参照してください）。脳全体が無効になっている場合、これは頻繁にスキャン中にも深い麻酔および/または酸素不足のしるしです。この例を図6Bに見ることができます。 図1大腿動脈および静脈にカニューレの配置の場所。 図2 MRIセットアップの概略表現は、 すべての機器は、非磁 ​​性である必要があり、呼吸および/ ​​または心臓の鼓動に起因する動きからの干渉を避けるため、画像のゲート取得を可能にするモジュールシステムに接続されています。体温は、撮像中に動物の温度を監視および制御する加熱モジュールを介して調節されている。 拡大画像を表示するには、ここをクリック 。 図3血圧データの代表例。直接注入​​（赤いバー）の開始後に表示血圧の明確な低下があります。正常値は10分以内に再度到達しています。チャレンジ投与後。 図4：MRI解析プログラムを使用して）期待される活性化パターンは、（赤が正の活性化、青は負の活性化である）を刺激。すべての動物のすべての活性化ボクセル（ベースラインから≥1％の変化）のB）の平均時間のコース。 C）FSL / FEAT。の結果のGLMモデルの例Clは拡大図を表示するには、ここをICK。 図5。 肯定的な活性化の例を示します。活性化ボクセル（赤）のタイムコースはほぼGLMモデルの形状を以下の通りです。薬剤の注入は時点8の周囲に開始しました。 深すぎる麻酔後、脳全体の負の活性化の例を示します。負の活性化ボクセル（青）のタイムコースは、信号の一般的な減少を示し、課題の影響は目に見えるではありません。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図6。 最初のレベルの分析の後に活性化パターンを期待しています。ボクセルのクラスターの活性化（yへの赤特定の脳領域でellow）。 "悪い"活性化パターンの一例。 図5Bのように同じ動物で、脳全体負の活性化（青）。