O Uso de desafio-Farmacológicas fMRI em pesquisa pré-clínica: aplicação ao sistema 5-HT

Preparação de animais para in vivo da RM 1. A canulação cirúrgico Anestesiar do rato (ratos Wistar macho, 200-300 g) com (indução de 5% e, em seguida, reduzido para 1,5-2% para manutenção da anestesia durante a preparação dos animais e digitalização) isoflurano dada em médica ar (21% de O 2, o BOC UK) . Assegurar que o animal está bem anestesiados e não exibe resposta a uma pitada dedo do pé. A artéria ea veia femoral são canulada para gasometria e aferição da pressão arterial e administração do desafio de drogas, respectivamente. Durante o procedimento cirúrgico, a temperatura corporal do animal é monitorizada e mantida através de uma sonda rectal e uma manta térmica (Harvard Apparatus). O animal anestesiado é posicionado sobre uma almofada de aquecimento sob um microscópio de dissecação em decúbito dorsal. Raspar a área meio da coxa e limpe a pele com álcool. Faça uma incisão na pele 2 cm ao longo do vinco formado pelo abdômen e coxa direita.Dissecção dos músculos adutores é usado para visualizar a artéria femoral veia eo nervo femoral. Separe cuidadosamente os vasos. Suavemente amarrá uma ligadura de seda completamente em torno da extremidade distai do navio e colocar outro laço com a metade de um nó cirúrgico solta no local proximal. Aplicar tracção para ambas as ligaduras, para ocluir o fluxo sanguíneo na porção média restante do vaso exposto entre as ligaduras. Fazer uma pequena incisão de cerca de um terço da circunferência vaso nesta parte do navio para permitir a inserção de uma cânula PE-50 (0,54 mm de diâmetro interno e 0,96 milímetros de diâmetro externo no caso de ratos machos adultos, caso contrário, 0,40 mm ID e 0,80 milímetros ED) para dentro do vaso. A cânula deve ser inserido vários mm (pelo menos 5) para dentro do vaso. Uma vez dentro do lúmen, lavar uma pequena quantidade de solução salina heparinizada (15 UI / ml) através do recipiente a fim de evitar qualquer formação de coágulo de sangue. O laço de seda proximal é também ligado completamente para fixar a cânula. REPEAT este procedimento para o segundo vaso. Cole a pele usando um adesivo de tecido Vetbond (3M UK plc, Bracknell, Reino Unido), quando ambas as cânulas estão no lugar. Ver Figura 1 para a colocação exacta das cânulas. Coloque o animal em uma cama estereotáxica MR compatível (m2m Imaging Corp, EUA) em decúbito ventral. Manter a cabeça do animal através da inserção de barras da orelha e uma barra de dente. Neste ponto, o animal pode ser colocada no aparelho de ressonância magnética para imagiologia. O animal permanece anestesiado e é a respiração livre durante todo o procedimento de imagem inteira. 2. Monitoramento Durante o procedimento de imagiologia inteiro, a várias respostas fisiológicas deve ser constantemente monitorizados e ser mantido tão constante quanto possível. Isto é essencial, uma vez que estas respostas podem variar grandemente ao longo da janela de tempo mesmo que o sinal de phMRI e também afectar o sinal de interesse. Também é importante, dado que o animal será colocado na magnet e é, portanto, fora da vista e não passíveis de verificações padrão de profundidade anestésica (por exemplo pitada tep), para garantir a profundidade anestésica adequada. Além disso, dado que muitas drogas alterar os parâmetros cardiovasculares, tais como pressão sanguínea, a medição destes é crítico para assegurar conta pode ser tomado de globais efeitos fisiológicos da acção da droga nos dados phMRI. Veja também a seção 4, para os valores iniciais e as respostas esperadas para a infusão de 5 fluoxetina mg / kg. A temperatura corporal é mantida a 37 ± 1,5 ° C por um sistema de aquecimento do ar de aquecimento (SA Instruments, New York, EUA). Esteja ciente de que RM pode afetar a medição de temperatura, verificar com o seu próprio sistema. Monitorar e gravar taxa de respiração do animal usando uma braçadeira respiratória acoplado ao sensor de pressão (SA Instruments, New York, EUA). Registrar a pressão arterial invasiva, usando um transdutor de pressão (TSD104A, Biopac Systems Corp, EUA) e, periodicamente, retirar umad analisar amostras de sangue arterial de gás (Rapidlab, Siemens de diagnóstico) através da artéria femoral canulado durante o exame para monitorar pCO 2 arterial ea pressão parcial de oxigénio (pO 2). Utilizar a veia femoral canulado como a linha de perfusão principal para o desafio farmacológico (fluoxetina solução (cloridrato de fluoxetina a partir de Sigma-Aldrich, Reino Unido), 5 mg / kg, dissolvido em solução salina). In vivo de imagem Uma representação esquemática da instalação experimental fMRI é dado na Figura 2. 3. Parâmetros de imagem Uma vez que o animal é colocado dentro do scanner e continua a mostrar estáveis ​​respostas fisiológicas, a imagem pode começar. Nos nossos estudos, foi utilizado um 4,7 T pequeno animal sistema RM (Agilent Technologies) com uma quadratura cilíndrico de transmissão / recepção bobina RF com 72 mm de diâmetro interno (m2m Imaging Corp, EUA). Faça uma imagem olheiro três avião corretamente para o POSIÇÃO o cérebro no meio do campo de vista e RM usar correcção calço localizada (sequência FastMap) para melhorar a homogeneidade do campo magnético no cérebro. Para cada animal, em primeiro lugar adquirir um T2 volume de imagem anatômica para fins de registro e segmentação. Utilizou-se uma sequência de eco de spin com turbo eco comprimento do comboio = 8; matriz tamanho = 256 x 256; FOV = 50 mm x 50 2; com a aquisição intercalada de 30 contíguos fatias coronais com 1 mm de espessura, centrado 8 milímetros caudal para a borda posterior do bulbo olfatório; médias = 4; TR / TE = 5112/60 ms. Certifique-se que o animal suas respostas fisiológicas são constantes antes de iniciar a digitalização phMRI. Para a aquisição de séries temporais, foi utilizada a mesma seqüência de T2-weighted turbo spin echo com echo comprimento do comboio = 16; matriz size = 128 x 128, com aquisição intercalada de 20 fatias contíguas com 1 mm de espessura centrado na mesma posição; TR / TE = 4915/60 ms. No total, foram adquiridos 32 pontos no tempo com um aQUISIÇÃO tempo de 158 segundos por volume de séries temporais e um tempo de varrimento total de 84 min. O primeiro volume é usado como um 'scan fictício' para tratar efeitos de saturação T1 e não é utilizado na análise dos dados. Sequências de ressonância magnética, tais como gradiente de eco ou planar de eco de imagem (EPI) sequências podem também ser utilizados. Certifique-se de avaliar a estabilidade do sinal da sua seqüência de escolha antes do início da sua experiência. Adquirir um número de volumes de base, antes de administrar a medicação desafio. Sugerimos, pelo menos, 10 minutos de aquisição de linha de base sob condições estáveis. Iniciar a infusão com exatamente o mesmo tempo para todos os animais. No nosso protocolo, que começou a administração no início do volume 9 (depois de cerca de 21 a digitalização de linha de base min). Após a infusão, a aquisição da imagem continuou por mais 60 minutos (32 volumes no total). Certifique-se o período pós-perfusão é suficiente para visualizar as mudanças e alcançar estado de equilíbrio ou recuperação do sinal, dependendo da sua pesquisa questiem sua escolha e de desafio de drogas. Quando a aquisição da imagem estiver concluído, remova o animal a partir do scanner. Realizar uma medição final de gases de sangue para assegurar a estabilidade dos parâmetros de gás do sangue e para permitir a avaliação dos efeitos da droga sobre a fisiologia de base. Informática 4. Respostas Fisiológicas Esperados respostas fisiológicas para o desafio são dependentes da droga escolhida. Abaixo, os valores de linha de base geralmente aceites (de ratos machos adultos) e as respostas esperadas para a infusão iv de 5 fluoxetina mg / kg são dadas. Taxa de respiração deve ser estável em 45-75 respirações por minuto. O desafio farmacológico da fluoxetina induz um aumento de curto (15-20%) na taxa de respiração. A pressão sanguínea deve ser constante e entre 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp, Goweta, EUA). O desafio fluoxetina induz uma gota curta mas íngreme de cerca de 20% na pressão do sangue arterial.Este deve se recuperar dentro de 5-10 minutos. Isto é mostrado na Figura 3. Gasometria deve ser estável (medir pelo menos duas vezes) e dentro das seguintes faixas antes de iniciar a digitalização phMRI: pCO 2, 35-45 mmHg, pO 2, 80-130 mmHg; pH, 7,35-7,45. Sempre verifique esses valores novamente após a verificação para ver se o animal manteve-se estável e para permitir a avaliação dos efeitos da droga sobre a fisiologia básica. Alta pCO 2 valores induzir vasodilatação e, assim, evitar a ver mudanças de sinal BOLD. Assegure-se que o animal está sob um nível contínuo e constante de anestesia (2 ± 0,25%; níveis mais elevados podem causar depressão de reactividade vascular cerebral e inferior anestesia insuficiente e, portanto, movimento), antes de iniciar a verificação phMRI e importante, evitar quaisquer ajustes na regime anestesia (por exemplo,% isoflurano e / ou gás) durante a aquisição de imagem funcional, pois isso pode também afetar o sinal BOLD. <p class = "jove_title"> 5. Dados pré-processamento de ressonância magnética Descrevemos aqui várias etapas no pré-processamento dos dados de RM, a fim de optimalize os dados para análise estatística. Mencionamos as ferramentas que são usadas no nosso laboratório, no entanto muitas ferramentas diferentes estão disponíveis. 5,1 preparação de dados Coloque as imagens raw no formato de arquivo correto para o software de análise de ressonância magnética que você prefere usar (ou NIfTI1.1 Analyze7.5 formato para os programas de FSL). Vários programas de conversão de arquivos gratuitos estão disponíveis online. Dependendo do scanner utilizada, pode ser necessário para construir um primeiro 3D (scan anatómica) ou 4D imagem (phMRI scan) de todas as fatias separadas 2D. Isto pode ser feito utilizando um programa de processamento de imagem, tais como ImageJ 1. A fim de assegurar a compatibilidade com algoritmos de análise concebidos para utilização com os dados humanos (por exemplo, programas de FSL), tamanho do voxel tem de ser multiplicada por um factor de 10 (isto também pode ser feita usando, por exemplo ImageJ). Em nosso estudo, isso resultou em um tamanho voxel de 3,91 x 3,91 x 10 mm 3. Verificar visualmente suas imagens por irregularidades na orientação, artefactos, e de movimento. Tenha cuidado para não usar exames com artefatos claros ou movimento excessivo em suas análises como eles vão distorcer-lhe resultados. Orientação de todas as verificações devem ser semelhantes entre as imagens anatômicas e funcionais e em concordância com o cérebro de referência utilizado. Em nosso estudo, foi utilizado o modelo cerebral estereotáxica rato descrito por Schwarz 14. O FSL comando fslswapdim pode ser usado para a reorientação. 5,2 correção de movimento Para corrigir quaisquer artefatos de movimento da série tempo 4D, foi utilizado o movimento McFlirt ferramenta de correção (correção de movimento usando a ferramenta FMRIB de Registro de Imagem Linear, parte da Biblioteca FMRIB de Software, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT é um intra-modal movimento de correção ferramenta designed para uso em séries temporais de fMRI e com base na otimização e técnicas de matrícula utilizadas nos FLIRT, uma ferramenta totalmente automatizado para linear (afim) registro de imagens inter-modal cérebro. Sempre verifique posteriormente se o resultado é satisfatório. 5,3 segmentação do cérebro Excluir todo o tecido não-cérebro de uma imagem de toda a cabeça para ambas as séries o tempo como a imagem anatômica 3D 4D. Para isso utilizamos a ferramenta BET FSL (Brain Extraction Ferramenta v 2.1, parte da Biblioteca FMRIB de Software, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). As configurações padrão são desenvolvidos para uso com cérebros humanos e são, portanto, não é o ideal para o cérebro de rato. Foram utilizados os seguintes parâmetros: limiar de intensidade fraccionada, f = 1.0, gradiente vertical em limiar de intensidade fraccionada, g = 0,1; raio e da cabeça (em mm), r = 175 para a maioria dos animais. Se necessário, você pode otimizar esses valores por disciplina. 6. Dados Analysis Objectivo da análise estatística dos dados MR é determinar os voxels que exibem variância adicional imputável ao desafio de droga de uma forma estatisticamente robusta. Diversas abordagens metodológicas estão disponíveis para este, assim como pacotes de software numeráveis. A escolha que você faz depende da disponibilidade de software e conhecimento / experiência em seu laboratório e sua questão de pesquisa específica. Aqui nós damos um método sugerido como é usado em nosso laboratório. 6,1 Antes de analisar os dados de ressonância magnética, determinar um modelo linear geral (GLM) para que os dados serão montados. Este pode ser um simples quadrado on-off do modelo (fora para a pré-droga e em pós para droga de infusão) ou um modelo específico com base nos dados. Temos utilizado o programa Estimular 21 a determinar um modelo GLM baseada em dados. Realizar uma de duas amostras de teste T-(por exemplo, em estimular) em todos os volumes de linha de base versus todos os volumes pós-desafio. Opcionalmente, deixe out o primeiro volume (s) e do volume durante o qual o desafio é dado, uma vez que aqueles que não podem representar de estado estacionário de imagem. Posteriormente, discriminar todos os voxels com mais de uma mudança certa% do valor basal. Usamos todos os voxels com mais de 1% de alteração. Em seguida, o curso do tempo médio, em todos estes voxels, que já lhe dá uma impressão da forma do modelo. Deste modo, pode ser determinado se o desafio 1) tem um efeito imediato ou retardado, 2), se e quando o efeito atinge um patamar e / ou de pico e, 3) se ou quando o efeito diminui de novo durante o curso de tempo do digitalizar. Exemplos são mostrados na Figura 4A e 4B. 6,2 O próximo passo é, então, para testar a estatisticamente bruto 4D imagem série de tempo de cada animal contra o modelo GLM previamente estabelecido. Para isso, usamos o programa FSL FEAT (Ferramenta de Análise de FMRI Expert, v5.98) 17,24. No entanto, outras ferramentas de análise de fMRI são available tão bem. Dentro da ferramenta de análise, uma análise de primeiro nível tem de ser configurado. Isto requer os seguintes passos: Certifique-se de usar as mesmas configurações para cada animal. Você pode optar por excluir os primeiros (dois) volumes antes da análise, uma vez que steady-state de imagem não pode ser alcançado ainda a esse ponto. Ajuste o TR; este é o tempo (em segundos) entre o início de cada volume sucessivo. Uma vez que você está olhando para os efeitos que podem durar o tempo de varredura inteira, não há necessidade de definir um filtro passa alta ou baixa. Espacialmente alisar os dados a fim de reduzir o ruído e melhorar a relação sinal-ruído (SNR). Nós escolhemos um kernel FWHM de 8 mm. Agora, execute o modelo GLM desejada em seus dados. Esta é a sua principal variável explicativa (EV), ou seja, a forma de onda que você está testando seus dados contra. O GLM que foi determinada com base nos nossos próprios dados pode ser visto na Figura 4C. Há também a possibilidade de adicionar adicional confundir EV, tais como parâmetros de movimento,ruído de baixa frequência (desvio scanner) ou até mesmo parâmetros fisiológicos como a pressão arterial para remover gerais fisiológicos de drogas de efeitos. Dentro FEAT: use filme prewhitening. Adicionar derivada temporal. Na guia Contrastes & F-testes, criar um contraste. Para converter um EV única em uma imagem estatística Z, defina o valor de contraste para 1. Isso dá a você todos os voxels em que seu curso de tempo pode ser significativamente explicadas pelo GLM. Definir o valor para -1 dará a ativação negativa. Depois de realizar o teste de estatística inicial, a imagem estatística resultante precisa ser limiarizadas para mostrar quais voxels ou grupos de voxels são ativados em um nível de significância particular. Correcção de comparações múltiplas é necessária devido ao grande número de voxeis cerebrais testados. A FEAT programa FSL utiliza um sistema automatizado baseado em cluster de correção para comparações múltiplas baseada na teoria GRF (Gaussian campo aleatório) 25. Finalmente, os dados devem ser espacialmente normalizados para uma imagem de referência, a fim de realizar as estatísticas do grupo. Primeiro registar os dados funcionais para os animais cérebro-extraída imagem anatómica e depois para a imagem de referência. Utilizou-se o modelo de cérebro de rato estereotáxica descrito por Schwarz 14 como um cérebro de referência. Depois disso, as análises do primeiro nível de todos os animais podem ser combinados em nível superior (grupo) análises estatísticas. Isso é altamente dependente de seu projeto próprio estudo e questões de pesquisa. 6,3 Depois disso, as análises do primeiro nível de todos os animais podem ser combinados em nível superior (grupo) análises estatísticas. Isso é altamente dependente de seu projeto próprio estudo e questões de pesquisa. 6,4 Respostas fisiológicas de drogas pode ser acoplado ou correlacionadas com o sinal MR, se desejado. Veja também a seção 6.2.3 sobre a adição de confundir EV. 7. Os resultados representativos ove_content "> Quando a droga desafiador (5 mg / kg iv fluoxetina) entra no sistema vascular, uma resposta clara fisiológicos devem ser visíveis na taxa de respiração (para cima) e pressão arterial (para baixo). Estas respostas normalizar num prazo médio de 5-10 min . Na Figura 3 esta queda da pressão arterial é claramente visível. O tempo médio de sinal deve mostrar uma linha de base relativamente estável e um efeito claro do desafio. De preferência, não deve haver nenhum desvio desafio independente no sinal. Um exemplo representativo de um curso de média do sinal de tempo pode ser visto na Figura 5A. Artifacts, tais como a depressão respiratória / falha ou alterações na anestesia são muitas vezes claramente visível no sinal. A depressão respiratória irá afectar negativamente o sinal em todo o cérebro. Isto pode ser visto na Figura 5B. Após análise primeiro nível, o padrão de activação é esperado ser principalmente positiva e located em regiões específicas apenas (ou seja, áreas corticais, hipocampo, hipotálamo eo tálamo; ver Figura 6A). Se o cérebro inteiro está desativado, esta é muitas vezes uma indicação de anestesia muito profunda e / ou falta de oxigênio durante a digitalização. Um exemplo disto pode ser visto na Figura 6B. Figura 1. Localização da colocação das cânulas na artéria e veia femoral. A Figura 2 representação esquemática da instalação RM;. Todo o equipamento tem de ser não-ferromagnético e está ligado a um sistema que permite módulo de aquisição de imagens gated evitando interferências de movimento devido à respiração e / ou batimento cardíaco. A temperatura corporal é também regulada através de um módulo de aquecimento para monitorar e controlar a temperatura do animal durante o exame. Clique aqui para ver a imagem ampliada . Figura 3. Exemplo representativo de dados de pressão arterial. Existe uma clara queda na pressão sanguínea visível directamente após o início da infusão (barra vermelha). Os valores normais são novamente alcançado dentro de 10 min. após a administração desafio. Figura 4. A) padrão de ativação esperado usando o programa de análise de ressonância magnética Estimular (vermelho é a ativação de positivo, o azul é a ativação negativo). B) O curso de tempo médio de todos os voxels ativados (≥ variação de 1% do valor basal) em todos os animais. C) Exemplo de o modelo GLM resultando em FSL / FEAT. Click aqui para ver maior figura. Figura 5. Exemplo de activação positiva. O curso de tempo nos voxels activados (vermelho) está seguindo aproximadamente a forma do modelo GLM. A infusão do fármaco iniciado em torno do ponto de tempo 8. Exemplo de ativação negativa no cérebro inteiro após a anestesia muito profunda. O tempo nos voxels negativamente ativados (azul) mostram um declínio geral no sinal e nenhum efeito do desafio é visível. Clique aqui para ver maior figura . Figura 6. Esperado padrão de ativação após a análise de primeiro nível. Ativação de grupos de voxels (vermelho para yellow), apenas em áreas específicas do cérebro. Exemplo de padrão de ativação "mau". Activação do cérebro inteiro negativo (azul) no mesmo animal como na Figura 5B.